[发明专利]一种提高非整合减毒李斯特菌疫苗安全性的方法

说明书

本公开涉及一种提高非整合减毒李斯特菌疫苗安全性的方法。具体来说，本公开的方法包括将重组核酸分子插入质粒或表达载体中来构建重组质粒或重组表达载体的步骤，以及将所述重组质粒或重组表达载体转染至李斯特菌中来得到重组李斯特菌的步骤。本公开的方法通过对载体上LLO进行不同程度缺失突变，检测突变后疫苗的表达、溶血性及抗肿瘤效应，获得优化疫苗载体，进一步提高李斯特菌疫苗安全性。

技术领域

本公开主要涉及生物技术领域。具体来说，本公开提供一种提高疫苗安全性的方法。更具体来说，本公开提供一种提高非整合减毒李斯特菌疫苗安全性的方法。

背景技术

单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes，Lm)是一种革兰氏阳性的胞内寄生菌[1]，可在上皮细胞、单核细胞及吞噬细胞等内存活并繁殖。由于其独特的侵染过程因此能够同时诱导炎症反应和激活MHC I型和II型抗原呈递途径的组合，使得李斯特菌成为一个具有很大应用前景的疫苗载体[2-4]。

单增李斯特菌溶血素LLO(Listeriolysin O)是单增李斯特菌对数生长后期分泌的一种外毒素，隶属于胆固醇细胞溶素家族(cholesterol-dependent cytolysins-CDCs)。LLO由hly基因编码，分子量约为58kDa。单增李斯特菌已进化出多种相互协同作用的毒力因子，这些毒力因子可破坏宿主细胞的功能以逃避免疫系统攻击。LLO在单增李斯特菌从吞噬泡内逃逸至细胞质中至关重要，同时LLO在细菌侵袭入细胞的过程中也发挥作用，并且可介导宿主细胞凋亡等过程[5]。在结构上，LLO的N端有一个信号肽，并且N端含有的由27个氨基酸组成的PEST-like区域，LM通过该区域对LLO进行精确调控，以免LLO裂解宿主细胞，使得菌体暴露在宿主细胞免疫系统的监控下。LLO的中间有两个跨膜区TMH1和TMH2，在跨膜区有一个酸性结构域，这个酸性结构域起pH感受器的作用，因此LLO的活性是由pH调节的，在酸性pH条件下才会形成35nm的孔。C端还含有一个保守的胆固醇结合区域，当细菌处于吞噬体内酸性环境(pH约5.5)时，LLO由前体蛋白成熟并开始发挥对吞噬体特异性的膜穿孔活性[6]。相比CDCs家族其他成员，LLO独特的选择膜穿孔活性使得LM进入宿主细胞质，发生细胞毒作用[7]。

由于LLO独特的生物学功能，被广泛应用于疫苗和抗肿瘤药物中，如在携带蛋白质或DNA的脂质体载体疫苗、减毒疫苗、亚单位及DNA疫苗中均有涉及[8-11]。同样，在李斯特菌疫苗中，也往往使用LLO带动外源抗原的表达[12-15]。然而，由于LLO是一种溶血素，如能对LLO进行缺失突变改造，在保证外源抗原的表达同时提高安全性，对其之后在临床上肿瘤免疫治疗具有重要的意义。

现有李斯特菌疫苗往往采取LLO融合外源抗原实现外源抗原的表达，进而激活抗原特异性的免疫反应，然而LLO潜在的毒副作用使得李斯特菌疫苗的应用存在安全隐患。因此急需找到既降低LLO毒性又确保不影响外源抗原表达进而实现抗肿瘤效应的方法。

参考文献：

[1]Ramaswamy V,Cresence V J,Lekshmi M,et al.Listeria-review ofepidemiology and pathogenesis[J].Journal of microbiology,immunology,andinfection＝Wei mian yu gan ran za zhi,2007,40(1):4.

[2]Cossart,P.,J.Pizarro-Cerda,and M.Lecuit,Invasion of mammaliancells by Listeria monocytogenes:functional mimicry to subvert cellμlarfunctions.Trends Cell Biol,2003.13(1):p.23-31.