[发明专利]用于检测PIK3CD基因E1021K位点突变的探针和引物组合及试剂盒

说明书

本发明提出一种用于检测人类PIK3CD基因C.3061G>A,P.E1021K位点突变的突变型及野生型探针和引物组合。正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述探针包括突变型探针，所述突变型探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。本发明通过设计科学合理的特异性的PIK3CD基因C.3061G>A,P.E1021K检测引物和探针，以更好的实现基于荧光定量PCR的方法检测，基于本发明提供的探针和引物的基础上所实现的荧光定量PCR的方法在保证高灵敏度和高特异性的基础上，实验周期更短、成本更低。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种用于检测人类PIK3CD基因c.3061G>A,p.E1021K位点突变的探针和引物组合及试剂盒。

背景技术

PI3K-δ过度活化综合征是由PIK3CD基因突变引起的一种常染色体显性遗传免疫缺陷病。该病通常表现为T细胞及B细胞分化和功能的缺陷。主要临床症状有：儿童期起病的反复呼吸道感染、淋巴结肿大、结节性淋巴样增生、脾大、进行性淋巴细胞减少、抗体应答缺陷以及CMV和/或EBV感染导致的病毒血症。虽然淋巴结病变和结节性淋巴样增生是非癌性的(良性的)，但PI3K-δ过度活化综合征也增加了形成癌症B细胞淋巴瘤的风险。该病起病早，病情重，严重者可致命。而该病可以通过雷帕霉素治疗，效果较好。因此早期诊断将有利于患儿的尽早治疗，挽救患者生命。

目前针对PI3K-δ过度活化综合征可以通过对PIK3CD全基因Sanger测序或高通量测序技术(Next generation Sequencing)对PIK3CD基因及其它基因进行深度测序，可以获得PIK3CD整个基因内的突变信息，但不可避免的存在测序成本高、实验周期长等缺点。前期研究发现c.3061G>A,p.E1021K为该病的突变热点，中华儿科杂志所报道的中国最大宗PI3K-δ过度活化综合征患者均为该点突变。因此如何实现快速的检测这个位点可以迅速的对该病进行初筛，缩短诊断周期、降低检测成本，成为本领域技术人员亟待解决的技术难题。

发明内容

本发明针对上述的技术问题，提出一种用于检测人类PIK3CD基因c.3061G>A,p.E1021K位点突变的探针和引物组合及试剂盒，以使PIK3CD基因c.3061G>A,p.E1021K位点突变的检测灵敏度更高、特异性更高且可重复性好，同时能够降低试验成本，实现PIK3CD基因c.3061G>A,p.E1021K位点突变的快速检测，并且能够区分野生型、杂合突变型及纯合突变型。如果该病存在体细胞突变或嵌合体，也可检测其突变频率。

一种用于检测人类PIK3CD基因c.3061G>A,p.E1021K位点突变的探针和引物组合，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述探针包括突变型探针，所述突变型探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

作为优选，所述正向引物、反向引物和所述突变型探针的摩尔比为1:1:1。

作为优选，所述探针还包括野生型探针，所述野生型探针的核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示。

作为优选，所述突变型探针和野生型探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团。

作为优选，所述荧光基团为FAM、CY5、HEX、VIC、ROX中的任一种。

其中所述荧光基团和淬灭基团可基于实际的使用需要或成本考虑进行筛选。具体的所述突变型探针的荧光基团为FAM，淬灭基团为BHQ1；所述野生型探针荧光基团为CY5，淬灭基团为BHQ2。或者所述所述突变型探针的荧光基团为CY5，淬灭基团为BHQ2；所述野生型探针荧光基团为FAM，淬灭基团为BHQ1。