[发明专利]一种VBNC状态阪崎肠杆菌的快速诱导形成方法

说明书

本发明提供了一种VBNC状态阪崎肠杆菌的快速诱导形成方法，首先将阪崎肠杆菌接种后培养至对数期，得到培养液；然后使用抗生素与上述培养液进行诱导培养，诱导培养的操作为：取培养液离心，取沉淀，重悬，诱导培养浓度至10⁸CFU/mL以下；其中，抗生素为氨苄青霉素，抗生素在诱导培养后的培养液中浓度为50~1600μg/mL。本发明提供的方法能够快速地诱导阪崎肠杆菌进入VBNC状态，同时采取常规培养复苏方法验证VBNC状态阪崎肠杆菌能够复苏，可恢复致病性。因此，本发明可为提高乳制品中阪崎肠杆菌检测的准确性奠定基础，有效地避免VBNC状态阪崎肠杆菌的存在而造成的潜在隐患。

技术领域

本发明属于微生物培养及检测技术领域，更具体地，涉及一种VBNC状态阪崎肠杆菌的快速诱导形成方法。

背景技术

细菌“活的非可培养”状态（viable but non- culturable state,VBNC）是细菌在受到外界不良环境的胁迫时，通过调整自身的代谢途径，进入的一种自我保护状态。在这个过程中，细菌的形态逐渐发生改变并且不能够在平板上生长繁殖，因此，常规的平板检测法不能检测到VBNC状态的细菌。但是，当外界的不良环境撤去后，VBNC状态的细菌会进行复苏，恢复可培养的能力。对于一些致病菌来说，VBNC状态下的致病菌通常不具备致病性，但致病菌的致病性能够随着VBNC状态的复苏而恢复，仍然会引起人类疾病。诱导致病菌进入VBNC状态的原因有很多种，极端温度、消毒剂和防腐剂的使用、抗生素的滥用以及低水分含量等因素都能够诱导其进入VBNC状态。而致病菌一旦进入VBNC状态，常规平板检测法很难将其检出，给食品安全带来了极大的隐患。

阪崎肠杆菌是近几年来乳制品中新出现的致病菌。新生儿的免疫功能不够完善，抵抗力较差，很容易误食被阪崎肠杆菌污染的奶粉而患上新生儿脑膜炎、小肠结肠炎等疾病。而进入VBNC状态的阪崎肠杆菌不仅常规平板检测方法无法检出，而且能通过复苏引起婴幼儿疾病，为婴儿饮食安全带来巨大隐患。因此，通过对阪崎肠杆菌进入VBNC状态诱导因素的研究，能够提高检测的准确性和效率，对降低食品安全问题起到了巨大作用。

发明内容

本发明针对于现有技术的不足，提供一种VBNC状态阪崎肠杆菌的快速诱导形成方法。

本发明采用以下技术方案实现上述技术目的：

一种VBNC状态阪崎肠杆菌的快速诱导形成方法，包括如下步骤：

S1.阪崎肠杆菌的增菌培养：将阪崎肠杆菌接种后，培养至对数期，得到培养液；

S2.阪崎肠杆菌VBNC状态的诱导：使用抗生素与步骤S1中的培养液进行诱导培养，诱导培养的操作为：取步骤S1中的培养液离心，取沉淀，重悬，诱导培养浓度至10⁸ CFU/mL以下；

其中，抗生素为氨苄青霉素，抗生素在诱导培养后的培养液中浓度为50~1600 μg/mL。

作为本发明的一种优选方案，步骤S1中增菌所用培养基为LB肉汤培养基、改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素或肠道菌增菌肉汤。

作为本发明的一种优选方案，改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素配置方法如下：取30~35g氯化钠，18~22g胰蛋白胨，3~6g乳糖，2~3g磷酸二氢钾，2~3g磷酸氢二钾，0.05~0.15g十二烷基硫酸钠溶于1L水，得到mLST溶液，加热搅拌，调节pH至6.8±0.2；8~12mg万古霉素溶解于10mL水中配置成万古霉素溶液；mLST溶液与万古霉素溶液的混合体积比为（50~200）：1。

选用LB肉汤培养基配置方法如下：取10g胰蛋白胨，5~7g酵母提取物、8~10g氯化钠，加双蒸水完全溶解后，用5mol/L的氢氧化钠调节pH至7.0~7.5，定容至1L，高压灭菌。