[发明专利]一种石蜡切片组织核酸的快速自动化提取方法与试剂

说明书

本发明公开了一种石蜡切片组织核酸的快速自动化提取方法与试剂，所述试剂包括脱蜡剂、蛋白酶溶液、裂解液、洗涤液A、洗涤液B和洗脱液；其方法为使用无毒的脱蜡剂快速脱蜡，乙醇洗涤后，含有SDS与尿素的蛋白酶加入裂解消化成液体，转移入自动化磁珠提取仪中提取，依次进行裂解与磁珠吸附、洗涤A、洗涤B、洗脱液，约30分钟的机内运行时间，可完成32份乃至96份样本的提取；本发明的石蜡切片组织核酸的快速自动化提取方法与试剂，在完成常规的第一次蛋白酶孵育后，将孵育溶解体系升温至高温后维持3~5分钟后取出，待其冷却至室温，再向该反应体系中加入蛋白酶，再孵育10~30分钟即可使组织完全溶解消失，无明显颗粒物，溶液清亮。

技术领域

本发明涉及一种石蜡切片组织核酸的快速自动化提取方法与试剂，属于生物医药技术领域。

背景技术

肿瘤基因检测是当前热门的临床分子诊断领域，通过对肿瘤组织DNA、RNA的分离纯化，进行核酸检测了解肿瘤的分子特征，从而预测、诊断肿瘤乃至判断患者预后、复发生存、药物疗效等；石蜡切片包埋组织是最常见的肿瘤基因检测样本，因为石蜡包埋是常温长期保存组织蛋白和核酸分子的经典方法，几乎所有医疗机构均会采用石蜡包埋方法保存肿瘤组织；在石蜡包埋过程中，新鲜组织经过有机溶剂固定和逐步脱水，组织中水的成分被石蜡油替代，从而使生物分子得到完整保存；而在石蜡包埋组织提取DNA和RNA的过程中，必须将组织中的石蜡成分溶出，由水来替代，成为脱蜡，脱蜡的组织一般采用蛋白酶进行消化，以释放DNA、RNA等物质；脱蜡和溶解过程一般由二甲苯和蛋白酶K来完成

一般石蜡切片组织要求厚度在5~6微米之间，薄的切片有利于二甲苯等溶剂的渗透和蛋白酶的消化，从而使提取更加彻底，但是在实际操作中，石蜡切片的厚度在不同医疗机构及不同医疗机构及不同的切片操作员切取时会有较大的差异；特别是进行核酸用量较大的基因检测如乳腺癌21基因表达定量时，检测者会要求切取较大量的石蜡组织，此时石蜡切片数量和切片厚度可能会显著增加；此时检测操作者会采用延长蛋白酶孵育时间的方法溶解较大量的石蜡组织，一般石蜡组织核酸提取时蛋白酶消化孵育时间为15分钟至3小时，但对于切片较厚且数量较多的石蜡切片，即使延长时间至24小时也无法将其彻底溶解，容器底部仍然会残留固体组织；孵育时间过长会使部分核酸物质出现降解和断裂，组织残余的存在不仅会使核酸提取量减少，而且会使已溶解消化部分组织所提取核酸对整个组织的代表性出现偏差，从而影响测定结果。

发明内容

为解决上述问题，本发明提出了一种石蜡切片组织核酸的快速自动化提取方法与试剂，提供了一种方便快捷，使用安全无毒的试剂，并进行操作。

本发明的石蜡切片组织核酸的试剂，包括脱蜡剂、蛋白酶溶液、裂解液、洗涤液A、洗涤液B和洗脱液；

所述脱蜡剂为D-柠檬烯；

所述蛋白酶溶液由5~20mg/ml蛋白酶K、0.1~0.8%SDS、0.2~9M尿素、5~200m M Tris-HCl、0.1~10m M EDTA.Na2组成；

所述裂解液由4.5M 硫氰酸胍、0.9%DTT、5%聚多卡醇、50m M柠檬酸钠缓冲液、4M尿素和0.5%SDS组成；

所述洗涤液A由2M硫氰酸胍、30%乙醇、0.25%SDS和2M尿素组成；

所述洗涤液B由80%乙醇、20m M氯化钠、2m MTris和0.1%Tween20组成；

所述洗脱液由10m M Tris-HCL和0.2m M EDTA组成。

进一步地，所述蛋白酶溶液由20mg/ml蛋白酶K、0.2%SDS、6M尿素、20m M Tris-HCl、2m M EDTA.Na2、5Mm 氯化钙和防腐剂组成。

进一步地，所述洗涤液A由2M硫氰酸胍,30%乙醇，0.25%SDS,2M尿素和色素组成，且洗涤液A其PH值为7.5。