[发明专利]基于整合素的表达判断奶牛人工受精成功与否的方法

权利要求书

1.一种基于整合素的表达判断奶牛人工受精成功与否的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤S1：于奶牛人工受精后的20天内，每天定期提取人工输精后的奶牛的血液，或者，仅提取受精后第10天、第13天、第16天及第19天的血液；步骤S2：从上述血液中提取DNA；

步骤S3：设计αv基因引物和β3基因引物；

步骤S4：利用步骤S3所设计的引物，对步骤S2中提取到的DNA进行PCR扩增；

步骤S5：对扩增后的DNA进行αv基因和β3基因的相对表达量的测定以及αv基因和β3基因蛋白质的表达水平的测定，根据测定结果判断奶牛是否成功受孕；其中，所述受孕为奶牛第二胎受孕；

所述步骤S5的判断原则包括：

若第13天的奶牛血液对应的扩增后的DNA相比第10天的奶牛血液对应的扩增后的DNA，其αv基因相对表达量提升了一倍以上，则奶牛成功受孕，若αv基因相对表达量变化不大，则奶牛未成功受孕；

所述步骤S3中，所设计的αv基因引物包括：αv基因上游引物αv-F：caagagcagcgaggactttg，以及αv基因下游引物αv-R：gccgataaacacatatgcgt；所设计的β3基因引物包括：β3基因上游引物β3-F：tggggctgatgactgagagaag，以及β3基因下游引物β3-R：acgcacttccagctctat。

2.如权利要求1所述的基于整合素的表达判断奶牛人工受精成功与否的方法，其特征在于，所述步骤S5中的判断原则还包括：

若第16天的奶牛血液对应的扩增后的DNA相比第13天的奶牛血液对应的扩增后的DNA，其αv基因相对表达量无明显变化，则奶牛成功受孕，若第16天的奶牛血液对应的扩增后的DNA相比第13天的奶牛血液对应的扩增后的DNA，其第16天的αv基因相对表达量占第13天的相对表达量值的5%以下，则奶牛未成功受孕；

若第16天的奶牛血液对应的扩增后的DNA相比第13天的奶牛血液对应的扩增后的DNA，其β3基因相对表达量提升了一倍以上，则奶牛成功受孕，若第16天的奶牛血液对应的扩增后的DNA相比第13天的奶牛血液对应的扩增后的DNA，其第16天的β3基因相对表达量占第13天的相对表达量的5%以下，则奶牛未成功受孕；

若第16天的奶牛血液对应的扩增后的DNA，其αv基因或β3基因的蛋白质表达水平，相比第10天的奶牛血液对应的扩增后的DNA，其αv基因或β3基因的蛋白质表达水平，提升了一倍以上，则奶牛成功受孕；若第16天的奶牛血液对应的扩增后的DNA，其αv基因或β3基因的蛋白质表达水平，相比第10天的奶牛血液对应的扩增后的DNA，其第16天的αv基因或β3基因的蛋白质表达水平占第10天的表达水平值5%以下，则奶牛未成功受孕。

3.如权利要求1所述的基于整合素的表达判断奶牛人工受精成功与否的方法，其特征在于：所述步骤S2中，提取的DNA的方法包括：

步骤S21，匀浆处理：取1mL冻存牛全血，加入3mL红细胞裂解液混合，室温静置10分钟，10000rpm离心1分钟，吸弃上清，收集红细胞沉淀；

步骤S22，分层：向收集的红细胞沉淀中加入500uL Trizol溶液，室温静置5分钟使红细胞沉淀充分溶解，再加入200uL氯仿摇匀后室温静置3分钟；

步骤S23，沉淀RNA：将步骤S22最后所得样品12000rpm下离心10分钟后，获得分三层样品，转移最上层的水相并向转移后的最上层的水相中加入400uL冰乙醇，室温静置10分钟，之后4摄氏度下12000rpm离心10分钟，取管底沉淀物即RNA；

步骤S24，漂洗RNA沉淀：向步骤S23所得RNA沉淀物中加入75%的乙醇溶液，震荡悬浮，后4摄氏度下6000rpm离心1分钟，吸弃上清，将沉淀室温晾干；

步骤S25：向步骤S24得到的RNA沉淀中加入50uL 无酶无菌水溶液溶解RNA沉淀；

步骤S26：溶解后的RNA进行反转录合成DNA。