[发明专利]基于整合素的表达判断奶牛人工受精成功与否的方法

说明书

本发明涉及基于整合素的表达判断奶牛人工受精成功与否的方法，通过研究奶牛在受孕前后的整合素αvβ3表达变化规律，探究其与奶牛早期妊娠的关系，筛选影响早期妊娠的因子，从而研发奶牛早期孕检的检测试剂盒。本发明提供的基于整合素的表达判断奶牛人工受精成功与否的方法，将奶牛的妊娠检测窗口提前到输精后的第16天，比目前常用方法提前了12天，可有效降低奶牛养殖业的繁殖成本，提高奶牛行业中母牛的利用效率，增加经济收入。

技术领域

本发明涉及分子生物学及遗传育种技术领域，具体涉及一种基于整合素的表达判断奶牛人工受精成功与否的方法。

背景技术

配种效率的高低对牧场的奶牛生产有着直接影响，输精后一段时间后对奶牛进行早期妊娠诊断，如果存在相关技术那么这段时间越早就越可以提前区分奶牛是否妊娠，从而可以提前对妊娠奶牛进行必要的保胎措施，并对未受孕的奶牛采取二次输精，将屡配不孕奶牛淘汰。目前孕期奶牛的成本主要包括饲料和人工，按照每头牛每天25元，每提前一天检测出一头奶牛受孕失败则养殖场将避免不必要支出25元，进而提高奶牛养殖场的经济收入。

众多妊娠检测中常见的有直肠触诊法、超声波检查法等临床诊断法和孕酮、早期妊娠因子等免疫诊断方法。以上检测方法在检测对象、检测成本、操作难度和对检测对象的伤害等方面表现各不相同，但就检测窗口的时间而言最早在输精后第28天。牛胚胎着床过程中子宫容受态建立发生在输精后第10到第20天，整合素αvβ3有可能在这段时间发生mRNA水平表达量的变化。如果将受孕率与整合素αvβ3在mRNA水平表达量建立联系，这一联系有可能成为把奶牛早期妊娠的检测窗口提前到第10-18天的理论基础。

整合素αvβ3是一种异二聚体的跨膜糖蛋白，主要功能是结合配体介导细胞之间、细胞与胞外间质之间的相互作用，研究发现其在奶牛早期妊娠中有重要作用。在胚胎着床过程相关研究证明整合素αvβ3参与了子宫内膜容受态的建立。目前在人的临床中提出整合素αvβ3与其配体的检测对子宫的容受态和非容受态进行鉴别。子宫容受态的建立与否是妊娠成功的重要影响因素，妊娠失败多发生在该阶段。因此在该阶段进行妊娠成功的检测十分有意义，可检测出多数妊娠失败。

发明内容

为将奶牛受孕检测时间提前，降低牛场成本，本发明提供了一种基于整合素的表达判断奶牛人工受精成功与否的方法，包括如下步骤：

步骤S1：于奶牛人工受精后的20天内，每天定期提取人工输精后的奶牛的血液，或者，仅提取受精后第10天、第13天、第16天及第19天的血液；

步骤S2：从上述血液中提取DNA；

步骤S3：设计αv基因引物和β3基因引物；

步骤S4：利用步骤S3所设计的引物，对步骤S2中提取到的DNA进行PCR扩增；

步骤S5：对扩增后的DNA进行αv基因和β3基因的相对表达量的测定以及αv基因和β3基因蛋白质的表达水平的测定，根据测定结果判断奶牛是否成功受孕；其中，步骤S5的判断原则包括：

若第13天的奶牛血液对应的扩增后的DNA相比第10天的奶牛血液对应的扩增后的DNA，其αv基因相对表达量有明显提高，则奶牛成功受孕，若αv基因相对表达量变化不大，则奶牛未成功受孕。

其中，所述步骤S5中的判断原则还包括：

若第16天的奶牛血液对应的扩增后的DNA相比第13天的奶牛血液对应的扩增后的DNA，其αv基因相对表达量无明显变化，则奶牛成功受孕，若第16天的奶牛血液对应的扩增后的DNA相比第13天的奶牛血液对应的扩增后的DNA，其αv基因相对表达量几乎没有，则奶牛未成功受孕；