[发明专利]先将片段进行融合然后转化构成载体的构建方法在审
| 申请号： | 201811586556.8 | 申请日： | 2018-12-24 |
| 公开（公告）号： | CN109652446A | 公开（公告）日： | 2019-04-19 |
| 发明（设计）人： | 米铁柱;张国栋;刘佳音;邹丹丹;徐春莹;罗碧;刘洋 | 申请（专利权）人： | 青岛袁策集团有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/84 | 分类号： | C12N15/84;C12N15/65;C12N15/11 |
| 代理公司： | 北京华仁联合知识产权代理有限公司 11588 | 代理人： | 李冰 |
| 地址： | 266000 山东省青岛市李*** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 连锁基因 构建 融合 表达盒 转化 质粒 基因 潮霉素抗性基因 报告基因 工程菌株 抗性基因 荧光蛋白 植株再生 转化载体 愈伤 去除 筛选 申请 | ||
1.一种先将片段进行融合然后转化构成载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、提取待转化作物DNA；
B、分别获得多种连锁基因表达盒；
C、获取去除Hpt基因的pCAMBIA1300质粒的；
D、各个表达盒的连接；
E、融合片段与pCAMBIA1300-hpt-质粒的连接。
2.根据权利要求1所述先将片段进行融合然后转化构成载体的构建方法，其特征在于，进一步包括：构建双T-DNA载体，其中一个T-DNA区含有三连锁基因，另一个T-DNA区含有抗性基因，用于愈伤转化及植株再生阶段的筛选；所述三连锁基因分别为：DsRed基因、EAT1基因、ZmAA基因。
3.根据权利要求2所述先将片段进行融合然后转化构成载体的构建方法，其特征在于，构建含有EAT1基因的T-DNA区的方法包括：以步骤A获得的DNA为模板，以为引物扩增水稻EAT1基因表达盒。
4.根据权利要求2所述先将片段进行融合然后转化构成载体的构建方法，其特征在于，构建含有DsRed基因的T-DNA区的方法包括：以含有DsRED片段的pGDR质粒为模板，利用引物扩增获得DsRED基因表达盒。
5.根据权利要求2所述先将片段进行融合然后转化构成载体的构建方法，其特征在于，构建含有ZmAA基因的T-DNA区的方法包括：以玉米DNA为模板，以为引物扩增得到基因ZmAA1基因表达盒。
6.一种在构建含有EAT1基因的T-DNA区的载体中使用的引物，其特征在于，引物序列为：
7.一种在构建含有DsRed基因的T-DNA区的载体中使用的引物，其特征在于，引物序列为：
8.一种在构建含有ZmAA基因的T-DNA区的载体中使用的引物，其特征在于，引物序列为：
9.一种如权利要求6-8中任一项引物在载体构建和或工程菌株构建中的应用。
10.一种如权利要求1-5中任一项所述构建方法构建的载体。
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