[发明专利]先将片段进行融合然后转化构成载体的构建方法

说明书

本申请公开了一种先将片段进行融合然后转化构成载体的构建方法，包括以下步骤：A、提取待转化作物DNA；B、分别获得多种连锁基因表达盒；C、获取去除Hpt基因的pCAMBIA1300质粒的；D、各个表达盒的连接；E、融合片段与pCAMBIA1300‑hpt‑质粒的连接。进一步包括：构建双T‑DNA载体，其中一个T‑DNA区含有三连锁基因，另一个T‑DNA区含有抗性基因，用于愈伤转化及植株再生阶段的筛选；所述三连锁基因分别为：DsRed基因、EAT1基因、ZmAA基因。本发明提供了一种基于DsRED荧光蛋白基因为报告基因的不含潮霉素抗性基因的工程菌株。本发明还提供了一种将片段进行融合，然后转化载体的一种实验新思路。

技术领域

本发明涉及基因工程遗传育种学和生物遗传改良技术领域，特别涉及一种先将片段进行融合然后转化构成载体的构建方法。

背景技术

水稻作为世界上超过一半人口的主食，是最重要的粮食作物之一.在过去的半个多世纪里，水稻育种取得了巨大的成功。

水稻的单位产量实现了倍增，部分地方甚至提高至3倍，这为保障世界粮食安全作出了巨大的贡献.但近十几年来水稻的产量停滞不前，这一方面是由于在育种技术上没有新的突破以及遗传多样性在栽培品种中的逐步变窄，另一方面也是因为频繁发生的病虫害以及旱灾等自然灾害使得水稻生产损失惨重。

然而，世界人口的持续增长以及社会经济的快速发展导致对粮食的需求不断增加。针对这些问题，我国学者提出了培育绿色超级稻的设想，围绕水稻抗病虫、抗旱、营养高效利用、优质、高产等五大重要性状，对水稻品种进行全面改良以实现农业的可持续发展。而转基因技术作为一种新兴的育种手段，在实现绿色超级稻目标上将发挥重要作用.

水稻的转基因研究始于20世纪80年代末期，迄今已有大量的转基因水稻研究被报道。

水稻转基因技术始于原生质体培养，1985年首次成功地从水稻原生质体再生完整植株；1988年在粳稻品种中获得第一批转基因水稻植株；1990年从籼稻品种ChinsurahBoro II中获得第一例转基因籼稻植株；1990年李宝健等用农杆菌感染水稻组织获得转化愈伤组织；1991年利用水稻幼胚作为受体材料，用基因枪法，成功获得转基因植株，并且转化效率明显提高。

从此，幼胚作为转基因受体材料得到广泛研究应用。1993年用农杆菌法在粳稻品种上获得了转基因植株，此后，基因枪轰击法和农杆菌介导法作为最有价值的转化途径广泛用于水稻转基因研究。

根据第三代不育系的原理，我们最终拿到的不育系不含有任何转基因元件，而得到的保持系则仅含有：筛选标记基因-花粉致死基因-育性恢复基因三个基因，其中筛选标记基因是红色荧光蛋白(DsRed)，来自礁珊瑚(Discosoma sp.)，利用种子特异表达的启动子使DsRed基因在种子种特异表达来筛选不育系的种子；花粉致死基因是玉米α淀粉酶基因(ZmAA1)，来自玉米，可使携带该基因的花粉粒败育；育性恢复基因在水稻中一般是普通隐性核不育基因，来自水稻本身，可使相应基因突变体株系恢复育性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供了一种先将片段进行融合然后转化构成载体的构建方法。本发方法将潮霉素抗性基因与红色荧光基因(DsRed)基因进行连锁后转化水稻成熟胚诱导的愈伤组织，在愈伤组织细胞培养筛选阶段加入潮霉素，同时结合红色荧光检测，快速、有效的筛选。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种先将片段进行融合然后转化构成载体的构建方法，包括以下步骤：

A、提取待转化作物DNA；

B、分别获得多种连锁基因表达盒；

C、获取去除Hpt基因的pCAMBIA1300质粒的；

D、各个表达盒的连接；

E、融合片段与pCAMBIA1300-hpt-质粒的连接。