[发明专利]山羊传染性胸膜肺炎支原体单克隆抗体制备方法

说明书

本发明公开了一种山羊传染性胸膜肺炎支原体单克隆抗体制备方法，采用山羊传染性胸膜肺炎支原体RPS11基因重组蛋白纯化抗原，按照常规方法免疫Balb/c小鼠，取其脾细胞与SP2/0骨髓细胞进行融合，经过3次亚克隆获得了3株杂交瘤细胞，分别为4E41E2、3G91C3、1B61E11,其亚型鉴定结果均为单一IgG1亚型。将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中制备腹水，收集腹水经过预处理后选用Protein G‑琼脂糖亲和层析柱纯化，经间接ELISA特异性抗体效价检测，结果显示小鼠腹水测定单克隆抗体的效价均高于10⁴。Western blot试验表明，制备的单克隆抗体可以与RPS11基因重组纯化蛋白抗原发生特异性反应。

技术领域

本发明涉及畜牧兽医技术领域，特别是一种山羊传染性胸膜肺炎支原体单克隆抗体制备方法及其应用。

背景技术

山羊传染性胸膜肺炎(Contagious Caprine Pleuropneumonia，CCPP)是山羊传染病中较为多发和流行的疾病之一。养殖生产中以咳嗽、高热、渐进性消瘦，肺实质、小叶间质及胸膜发生浆液性和纤维性炎，肺有明显肝变等为主要临床病理特征，在夏末和秋季，气温骤变或长途运输应激时较常发生和流行。根据贵州省畜牧兽研究所对贵州部分地区非免疫山羊群的CCPP血清学调查实验表明，山羊传染性胸膜肺炎已成为一种影响贵州山羊养殖的主要危害传染性疫病，该病发生由于潜伏期较长，当临床症状明显时往往处于发病晚期，给治疗带来困难，临床发病羊只多为预后不良，加之该病为条件性传染性疫病，生产上盲目使用药物给病原分离诊断带来困难。

发明内容

本发明的目的是为克服现有技术缺陷，提供一种山羊传染性胸膜肺炎支原体单克隆抗体的制备方法及其应用。

本发明的技术方案如下：

山羊传染性胸膜肺炎支原体单克隆抗体制备方法采用山羊传染性胸膜肺炎支原体RPS11基因质粒重组pet28α-RPS11蛋白纯化抗原，按照常规方法免疫Balb/c小鼠，取其脾细胞与SP2/0骨髓细胞进行融合，经过3次亚克隆获得了3株杂交瘤细胞，分别为4E4 1E2、3G9 1C3、1B6 1E11,其亚型鉴定结果均为单一IgG1亚型。将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中制备腹水，收集腹水经过预处理后选用Protein G-琼脂糖亲和层析柱纯化，经间接ELISA特异性抗体效价检测，结果显示小鼠腹水测定单克隆抗体的效价均高于10⁴。Western blot试验表明，制备的单克隆抗体可以与RPS11基因重组纯化蛋白抗原发生特异性反应。

本发明应用获得的羊肺炎支原体RPS11基因重组纯化蛋白作为免疫抗原，采用单克隆抗体制备技术，获得了3株单克隆抗体，并对其进行了鉴定，拟将为山羊传染性胸膜肺炎ELISA、胶体金等特异性快速特异性诊断试剂的研发奠定良好基础。

附图说明

图1展示了RPS11四免效价趋势；图中：1-4为小鼠编号；样品稀释度：1/128000；检测结果：阳性；

图2展示了WB检测结果，图中：Primary antibody:Lane1：杂交瘤细胞培养上清4E41E2；Lane2：杂交瘤细胞培养上清3G91C3；Lane3：杂交瘤细胞培养上清1B6 1E11；Secondantibody:IgG(H+L)-HRP(1:5000)；Marker：180/130/95/72/55/43/34/26/17(kDa)。

具体实施方式

下面通过实例对本发明进一步具体描述。本发明设计的思想或同类物质的简单替代属于本发明的保护范围。下述方法中所涉及配料或材料，如无特殊说明，均为商业途径可获得。相关实验方法中如无特殊说明的均为本技术领域现有常规方法。其中的数值或数值比例，如无标注，均指质量数值或质量比例。

实施例1：

1试验材料