[发明专利]抗体人源化改造方法

说明书

本发明公开一种抗体人源化改造方法，使用N‑糖苷酶处理抗体人源化改造过程中的经纯化后的IgG抗体蛋白；所述N‑糖苷酶为PNGaseF酶，所述PNGaseF酶特异性识别蛋白中的序列Asn‑X‑Ser/Thr，完全去除糖基化的同时保留抗体蛋白中的二硫键；X代表除了脯氨酸外任意一种氨基酸。本发明还提供上述方法的具体应用。本发明的方法能够有效的对现有技术中部分抗体在抗体人源化改造后期时仍存在的无法替换的氨基酸进行替换。通过上述方法，可以尽可能多的保留经过筛选且合适的人源序列、降低免疫反应的目的，同时又能够最大限度的保留其特异性和亲和力，从而达到合理的人源化的效果。

技术领域

本发明属于分子生物学中抗体人源化设计研究领域，尤其是涉及到利用N-糖苷酶来去除可能影响到抗体互补决定区构象的N-糖基，以维持抗体分子的单一度和纯净度。

背景技术

目前，抗体人源化设计作为一种新的研发趋势，已经成为了当今治疗性抗体研发的过程中的重要环节。

抗体人源化：是一个复杂的过程，主要通过分子生物学实验手段，辅以计算机对抗体蛋白质结构的预测和模拟，使鼠源单克隆抗体序列改造为与人源抗体序列尽可能相近的一种分子生物学操作方法。通过这种方法改造成功后的抗体，既保留了原本鼠源抗体的亲和力和特异性，又降低了对人体造成的免疫副反应。但是在这个过程中，由于单克隆抗体蛋白分子结构的不完全确定性，或由于其分子结构本身的缺陷(如天然存在的糖基化的位点，空间结构中不合适的半胱氨酸的分布，还有一些容易导致脱酰胺作用出现的位点)，导致了不是所有的抗体蛋白都能被顺利的人源化。

人源化抗体：是经由抗体人源化处理后的一种产物，一般包括嵌合抗体，改型抗体，表面重塑抗体和全人源化抗体等。处理后的抗体由于其大部分氨基酸序列被人源序列取代，所以对人体造成的免疫副反应有一定程度的降低。

糖基化：是蛋白质翻译后修饰中最主要的修饰方式之一，在蛋白质的翻译调控和降解中起到非常重要的作用。在已有的商业化抗体药物中和在研的抗体药物中均发现带有糖基化。根据蛋白质和对应糖链的连接方式，可大致分为N-连接，O-连接，C-甘露糖这三种基本糖基化形式，再外加糖基磷脂酰肌醇锚定连接这种特殊形式。其中与本发明密切相关的是抗体蛋白结构中有较高概率存在的N-连接糖基化。

N-连接糖基化：是一种新生肽链的糖基化修饰形式。糖通过与肽链中的天冬酰胺的自由NH₂基团连接，主要的表现形式为Asn-X-Ser/Thr(X代表除了脯氨酸外任意一种氨基酸)结构的Asn酰胺基氨基与寡糖链(GlcNAC的β-羟基)N-连接糖蛋白。因此，将这种糖基化称为N-连接的糖基化。根据他们的外层链结构的不同，可分为：高甘露糖型，杂合型，复合型三种。它们的区别是，高甘露糖型只含有多个α-连接的甘露糖残基，复杂型含有以岩藻糖，半乳糖和唾液糖为组分的糖链残基，杂合型则同时具有以上两种特点。

就现有技术而言，在抗体人源化改造过程中，部分抗体的关键区域仍存在无法替换的氨基酸，无法完成最后的人源化步骤。现有技术难以有效解决这一问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种抗体人源化改造方法，能有效的对现有技术中部分抗体在抗体人源化改造后期时仍存在的无法替换的氨基酸进行替换。通过上述方法，可以尽可能多的保留经过筛选且合适的人源序列、降低免疫反应的目的，同时又能够最大限度的保留其特异性和亲和力，从而达到合理的人源化的效果。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种抗体人源化改造方法，使用N-糖苷酶处理抗体人源化改造过程中的经纯化后的IgG抗体蛋白；所述N-糖苷酶为PNGaseF酶，所述PNGaseF酶特异性识别蛋白中的序列Asn-X-Ser/Thr，完全去除糖基化的同时保留抗体蛋白中的二硫键；X代表除了脯氨酸外任意一种氨基酸。