[发明专利]一种微生物发酵法制备咔唑霉素B的方法

说明书

本发明公开了一种微生物发酵法制备咔唑霉素B的方法，属于生物技术领域。该方法主要步骤包括菌种活化、液体种子制备、液体发酵，发酵微生物选择藤黄轮丝链霉菌菌株HY61。采用本发明所述的发酵方法，整个发酵过程操作简单，发酵产物咔唑霉素B的含量高，通用性强，生产成本低。

技术领域

本发明涉及在藤黄轮丝链霉菌中合成咔唑霉素B的方法，属于生物技术领域。

背景技术

咔唑霉素是具有抗真菌、细菌及酵母菌的广谱抗生素，共有8种同系化合物，分别为A、B、C、D、E、F、G、H，同时咔唑霉素B亦是5-脂肪氧合酶的活性抑制剂，具有抗氧化活性。在医药、植物生防领域具有重要用途，因此具有庞大的市场需求和广阔的市场前景。

咔唑霉素B首次在Streptoverticillium ehimense H1051-MY 10培养液中分离得到并鉴定化学结构，此后鲜有其他种属微生物合成咔唑霉素B的报道。咔唑霉素B的化学全合成过程复杂，步骤多，收率低，无法满足工业化生产。生物发酵咔唑霉素B具有稳定、安全、无污染的优点，是最有前景的生产方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种微生物发酵法制备咔唑霉素B的方法，所述方法利用藤黄轮丝链霉菌发酵生产咔唑霉素B，菌体生长快，发酵周期短，生产成本低。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

一种微生物发酵法制备咔唑霉素B的方法，所述的咔唑霉素B生产菌为藤黄轮丝链霉菌菌株HY61(Streptomyces luteoverticillatus)；具体包括以下步骤：

(1)菌株活化：挑取藤黄轮丝链霉菌株HY61菌种划线接种至固体斜面培养基，于恒温培养箱22～30℃培养5～7d，待斜面长出大量孢子用于转接液体种子；

(2)液体种子制备：挑取步骤(1)的活化菌株接种于装有种子培养基的容器中，纱布封口，于22-30℃，150～220r/min摇床振荡培养30～72h，长出大量菌丝球或菌丝体，得液体种子；

(3)液体发酵：按体积比10～20％接种量向发酵培养基接入步骤(2)制备的液体种子，转速200～850r/min，溶氧控制45～50％，温度22～28℃，待初始葡萄糖耗尽后流加葡萄糖溶液并维持一定浓度，发酵24h后补入咔唑霉素合成的前体物质，发酵过程中流加酸碱调节剂维持pH6.5～7.5，通气培养48～72h；发酵结束后用正丁醇萃取发酵液中的咔唑霉素B，测定发酵效价。

所述的固体斜面培养基：可溶性淀粉20g/L，KNO₃ 1g/L，MgSO₄ 0.5g/L，NaCl 0.5g/L，KH₂PO₄ 0.5g/L，FeSO₄ 0.01g/L，琼脂20g/L，pH7.2～7.4，121℃高压蒸汽灭菌20min；

所述的液体种子培养基：葡萄糖10g/L，酵母浸粉2g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 5g/L，pH7.2～7.4，121℃高压蒸汽灭菌20min；

所述的发酵培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉2g/L，KNO₃ 0.4g/L，MgSO₄4g/L，KH₂PO₄ 0.5g/L，CaCl₂ 5mg/L，VB₁ 0.5mg/L,核黄素0.5mg/L，V_H 0.5mg/L，烟酸1mg/L，FeSO₄ 0.5mg/L，MnSO₄ 0.5mg/L，pH7.2～7.4，121℃高压蒸汽灭菌20min。

进一步，所述的发酵过程中酸碱调节剂为25％氨水、20％NaOH及10％的HCl中的一种。