[发明专利]一种游离巯基的检测方法

说明书

本发明公开了一种游离巯基的检测方法，该检测方法包括以下步骤：1)反应液制备：先配制浓度为0.1mol/L的硫酸钠溶液，再加入EDTA得到浓度为1mmol/L的EDTA反应液；2)工作液制备：将Ellman试剂溶解于反应液中，配制浓度为10mmol/L的工作液；3)标准品溶液制备；4)取样供试；5)测定计算：将待测样品或标准品在412nm处测定吸光度，以标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，计算待测样品浓度。本发明的检测方法操作简单，成本低廉，样品量低，最多能同时检测91个样品，检测时间大大减少，仅需15min。

技术领域

本发明涉及蛋白质巯基检测技术领域，具体涉及一种游离巯基的检测方法。

背景技术

蛋白质中的自由巯基是生物制药过程中质量监测的一个重要检测项目，目前常见的巯基含量测定方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳法(CE)、液相色谱-质谱联用法(HPLC-GC)等。其中，液相色谱法使自由巯基检测灵敏度和准确度有所提高，但是操作相对复杂，对仪器的依赖性高，且耗时较长，不能同时检测多个样品。

Ellman试剂为5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)，与自由巯基反应后生成2-硝基-5-巯基苯甲酸，在412nm处有强吸收峰，是一种经典的自由巯基定量检测方法，这种方法简单快速，反应条件温和，被中国药典收录为蛋白质自由巯基检测方法。该法可以同时测定总自由巯基，受到广泛使用，但是，该法在操作中具有一定的局限性。首先，传统的紫外分光光度计检测法需要的样品量较多，不适合少量样品的检测；其次，受限于仪器通量，无法同时快速测定多个样品。

此外，本发明所使用的检测设备为酶标仪。酶标仪实际上就是一台变相光电比色计或分光光度计，其基本工作原理与主要结构和光电比色计基本相同。光源灯发出的光波经过滤光片或单色器变成一束单色光，进入塑料微孔极中的待测标本。该单色光一部分被标本吸收，另一部分则透过标本照射到光电检测器上，光电检测器将待测标本不同而强弱不同的光信号转换成相应的电信号，电信号经前置放大、对数放大、模数转换等信号处理后送入微处理器进行数据处理和计算，最后由显示器和打印机显示结果。但是，在酶标仪的实际使用中发现，存在以下问题：1、测量室的密封性较差，加上缺乏精确的温度控制结构，使得温控不准确，热量容易从盖板与测量室的缝隙处流失，外部的光线如果照射或折射进入光电检测器件上，会严重影响仪器的检测结果；2、现有的酶标孔板上大多设置为96个微孔杯，微孔杯与酶标孔板是一体设置的，如果一次检测没有使用完全，需要对全部的微孔杯进行清洗或整体替换，大大增加了清洗或检测成本。

发明内容

为了克服上述的技术问题，本发明的目的在于提供一种游离巯基的检测方法，该检测方法操作简单，成本低廉，样品量低，最多能同时检测91个样品，检测时间大大减少，仅需15min，而以每个样品3min为例，高效液相色谱检测91个样品需要273min；同时检测方法适用的酶标仪，其测量室具有良好的气密性，检测腔室内部温度感应灵敏，微孔杯清洗更换方便，大大节约了检测成本。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种游离巯基的检测方法，包括以下步骤：

1)反应液制备：称取硫酸钠，加水溶解，摇匀后，加入氢氧化钠调节pH至8.0，再加水定容，得到浓度为0.1mol/L的硫酸钠溶液；称取EDTA并添加至至硫酸钠溶液中，混匀，得到浓度为1mmol/L的EDTA反应液；

2)工作液制备：按照每0.004g Ellman试剂对应1mL反应液，将Ellman试剂溶解于步骤1)制备的反应液中，配制浓度为10mmol/L的工作液；

3)标准品溶液制备：按照每13.17mg半胱氨酸盐酸盐对应50mL反应液，将半胱氨酸盐酸盐溶解于反应液中，制得浓度为1.5mM的标准品储备液，使用反应液梯度稀释得标准品溶液；