[发明专利]一种猪繁殖与呼吸综合症病毒重组质粒及其构建方法在审
| 申请号： | 201811596630.4 | 申请日： | 2018-12-26 |
| 公开（公告）号： | CN109735551A | 公开（公告）日： | 2019-05-10 |
| 发明（设计）人： | 陈陆;石昂;常洪涛;王永生;王新卫;高冬生;王川庆 | 申请（专利权）人： | 河南农业大学 |
| 主分类号： | C12N15/40 | 分类号： | C12N15/40;C12N15/63 |
| 代理公司： | 郑州豫开专利代理事务所(普通合伙) 41131 | 代理人： | 张智伟 |
| 地址： | 450002*** | 国省代码： | 河南;41 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 重组质粒 构建 繁殖与呼吸综合症病毒 种猪 猪繁殖与呼吸综合症 特异性体液免疫 黏膜免疫反应 免疫兔子 免疫原性 修饰型 诱导 蛋白 | ||
1.一种猪繁殖与呼吸综合症病毒重组质粒，其特征在于：所述重组质粒为pZJ-GP5-2A-M、pZJ-GP5-2A-M-2A-IL-18、pZJ-GP5m、pZJ-GP5m-2A-IL-18或pZJ-IL-18，其中GP5m是指修饰型GP5。
2.一种如权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合症病毒重组质粒的构建方法，其特征在于：
（1）、设计PCR扩增GP5、G-GP5m、D-GP5m、G-2A-M、D-2A-M、2A-IL-18、IL-18的引物，分别为：
G-GP5m F：如SEQ ID No.1所示；G-GP5m R：如SEQ ID No.2所示；
D-GP5m F：如SEQ ID No.3所示；D-GP5m R：如SEQ ID No.4所示；
G-2A-M F：如SEQ ID No.5所示；G-2A-M R：如SEQ ID No.6所示；
D-2A-M F：如SEQ ID No.7所示；D-2A-M R：如SEQ ID No.8所示；
2A-IL-18 F：如SEQ ID No.9所示；2A-IL-18 R：如SEQ ID No.10所示；
GP5 F：如SEQ ID No.11所示；GP5 R：如SEQ ID No.12所示；
IL-18 F：如SEQ ID No.13所示；IL-18 R：如SEQ ID No.14所示；
其中：G-GP5m F和G-GP5m R用于构建重组质粒pZJ-GP5m-2A-IL-18的GP5m序列扩增；D-GP5m F和D-GP5m R用于构建重组质粒pZJ-GP5m的GP5m序列扩增；G-2A-M F和G-2A-M R用于构建重组质粒pZJ-GP5-2A-M-2A-IL-18的2A-M序列扩增；D-2A-M F和D-2A-M R用于构建重组质粒pZJ-GP5-2A-M的2A-M序列扩增；2A-IL-18 F和2A-IL-18 R用于构建重组质粒pZJ-GP5-2A-M-2A-IL-18和pZJ-GP5m-2A-IL-18的2A-IL-18序列扩增；GP5 F和GP5 R用于构建重组质粒pZJ-GP5-2A-M-2A-IL-18和pZJ-GP5-2A-M的GP5序列扩增；IL-18 F和IL-18 R用于构建重组质粒pZJ-IL-18的IL-18序列扩增；其中，G-GP5m不含GP5m基因的终止密码子，D-GP5m含GP5m基因的终止密码子，G-2A-M含有2A肽序列但不含M基因的终止密码子，D-2A-M含有2A肽序列和M基因的终止密码子，2A-IL-18含有2A肽序列和IL-18基因的终止密码子，GP5不含GP5基因的终止密码子，IL-18含IL-18基因的终止密码子；
（2）、外源性基因GP5、G-GP5m、D-GP5m、G-2A-M、D-2A-M、2A-IL-18、IL-18的RT-PCR扩增
从PRRSV ATCC-VR2332中提取RNA，采用引物Random进行RT反应；以RT反应的产物cDNA为模板，应用PCR技术通过高保真聚合酶GXL扩增外源性基因，扩增完成后，琼脂糖凝胶电泳并回收外源性基因片段，备用；
（3）、重组质粒pZJ-GP5-2A-M、pZJ-GP5-2A-M-2A-IL-18、pZJ-GP5m、pZJ-GP5m-2A-IL-18、pZJ-IL-18的构建
（3.1）pZJ-GP5-2A-M-2A-IL-18的构建：
（3.1.1）EcoR I和Xba I双酶切GP5，Xba I和Sph I双酶切G-2A-M，EcoR I和Sph I双酶pMD18-T载体，回收酶切后的GP5、2A-M和pMD18-T，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pMD-GP5-2A-M；
（3.1.2）EcoR I和Sph I双酶切pMD-GP5-2A-M，Sph I和BamH I双酶切2A-IL-18，EcoR I和BamH I双酶切pZJ-1载体，回收酶切后的GP5-2A-M、2A-IL-18和pZJ-1，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pZJ-GP5-2A-M-2A-IL-18；
（3.2）pZJ-GP5-2A-M的构建：
（3.2.1）EcoR I和Xba I双酶切GP5，Xba I和BamH I双酶切D-2A-M，EcoR I和Sph I双酶切pMD18-T载体，回收酶切后的GP5、2A-M和pMD18-T，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pMD-GP5-2A-M；
（3.2.2）EcoR I和BamH I双酶切pMD-GP5-2A-M，EcoR I和BamH I双酶切pZJ-1载体，回收酶切后的GP5-2A-M和pZJ-1，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pZJ-GP5-2A-M；
（3.3）pZJ-GP5m-2A-IL-18的构建：
（3.3.1）EcoR I和Sph I双酶切G-GP5m，Sph I和BamH I双酶切2A-IL-18，EcoR I和SphI双酶切pMD18-T载体，回收酶切后的GP5m、2A-IL-18和pMD18-T，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pMD-GP5m-2A-IL-18；
（3.3.2）EcoR I和BamH I双酶切pMD-GP5m-2A-IL-18，EcoR I和BamH I双酶切pZJ-1载体，回收酶切后的GP5m-2A-IL-18和pZJ-1，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pZJ-GP5m-2A-IL-18；
（3.4）pZJ-GP5m的构建：
（3.4.1）EcoR I和BamH I双酶切D-GP5m，EcoR I和Sph I双酶切pMD18-T载体，回收酶切后的GP5m和pMD18-T，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pMD-GP5m；
（3.4.2）EcoR I和BamH I双酶切pMD-GP5m，EcoR I和BamH I双酶切pZJ-1载体，回收酶切后的GP5m和pZJ-1载体，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pZJ-GP5m；
（3.5）pZJ-IL-18的构建：
（3.5.1）EcoR I和BamH I双酶切IL-18，EcoR I和Sph I双酶切pMD18-T载体，回收酶切后的IL-18和pMD18-T，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pMD-IL-18；
（3.5.2）EcoR I和BamH I双酶切pMD-IL-18，EcoR I和BamH I双酶切pZJ-1载体，回收酶切后的IL-18和pZJ-1，T4DNA连接酶作用下进行连接反应，之后进行质粒转化，菌液PCR筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pZJ-IL-18。
3.如权利要求2所述的猪伪狂犬病重组病毒株的构建方法，其特征在于：步骤（3）中，所述pZJ-1载体的序列如SEQ ID No.15所示。
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