[发明专利]用于检测JAK2V617F突变的试剂盒

权利要求书

1.一种用于检测JAK2V617F突变的试剂盒，包括PCR反应液、标准品、阴性质控，其中，所述PCR反应液包括：1mM MgCl₂、10mM的Tris-HCl pH值为9.0、50mM KCl、0.1％TritonX-100、0.1mg/mL BSA、200μm dNTPs、0.25pmol正向外引物、0.25pmol反向外引物、0.25pmol正向内引物、0.25pmol反向内引物、0.25pmol内参正向引物、0.25pmol内参反向引物、0.1pmol探针引物、0.1pmol内参探针引物。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述引物和探针包括：

3.权利要求1所述试剂盒的制备方法，包括：分析JAK2V617F基因序列,结合ARMS-PCR方法的特点，选取含有突变位点的一段长248bp的序列作为扩增片段，设计二对内、外引物及一条探针引物，另外再以人β-actin基因为内参，设计一对内参引物及内参探针。

4.权利要求1所述试剂盒的用途，包括：用于PV的诊断、鉴别以及临床的预后判断，从而能够进行早期发现和确诊及时进行干预，避免发展成出血或血栓，或者能够监测预后，延长患者寿命。

5.权利要求1所述试剂盒用于检测JAK2V617F突变的测试方法，包括：

1)将试剂盒内所有组分冰上融化，混匀并短暂离心，置于冰上；

2)往含有样品的PCR管加入反应液，按照设计试剂用量配置反应体系，突变基因检测和内参检测在同一管中进行，每次检测反应分别设置标准品对照和阴性质控品对照；

3)依次加样后，盖上PCR反应管并离心，使所加试剂聚集到管底，放入仪器样品槽；

4)按对应顺序设置标准品、阴性对照及样本名称；

5)荧光检测通道选择：突变基因选择FAM通道，内参基因选择VIC通道，参比荧光设置为ROX；

6)设定荧光定量PCR反应条件：

第一步：95℃5min，1个循环，

第二步：95℃25s，68℃20s，72℃20s，17个循环，

第三步：93℃25s，60℃20s，72℃20s，50个循环；

在第三步时收集荧光信号，包括：在第三阶段60℃时收集FAM和VIC信号，执行实时PCR，保存测试文件。