[发明专利]一种原代肿瘤细胞分离培养方法

权利要求书

1.一种用于培养原代肿瘤细胞的原代细胞超低粘附培养皿，其特征在于，所述原代细胞超低粘附培养皿的铺制方法如下：

a)将聚甲基丙烯酸2-羟乙脂Poly-HEMA溶解于纯乙醇中得到Poly-HEMA胶，其中所述Poly-HEMA胶中Poly-HEMA的终浓度≥20mg/mL；

b)将配置好的Poly-HEMA胶覆盖于培养皿底部，吸干残余胶，放置于细胞培养超净台中紫外照射，吹风过夜至完全干燥，制备得到所述原代细胞超低粘附培养皿。

2.根据权利要求1所述的原代细胞超低粘附培养皿，其特征在于，所述Poly-HEMA胶中Poly-HEMA的终浓度为20～100mg/mL。

3.根据权利要求1或2所述的原代细胞超低粘附培养皿，其特征在于，所述Poly-HEMA胶中Poly-HEMA的终浓度为20mg/mL。

4.一种原代肿瘤细胞分离培养方法，包括如下步骤：

a)组织处理、消化、分离

肿瘤标本去除肿瘤组织周围的坏死及非肿瘤组织，剪碎、消化，所得消化后组织经金属筛网过滤、离心后PBS重悬，再经离心，弃上层清液，得分离后的组织细胞；

b)无血清超低粘附培养

将分离后的组织细胞用原代细胞无血清培养基重悬得到重悬液，调整细胞密度，以1×10⁶个/L浓度接种于原代细胞超低粘附培养皿中培养；每隔48小时，离心收集细胞后弃掉原有的原代细胞无血清培养基上清，再用原代细胞无血清培养基重悬换液，继续在所述原代细胞超低粘附培养皿中培养至1周以上，得到无血清培养的原代细胞球；

c)按照常规细胞培养方法进行扩增，得到高纯度的原代肿瘤细胞。

5.根据权利要求4所述的原代肿瘤细胞分离培养方法，其特征在于，步骤b)中，所述原代细胞无血清培养基为向基础培养基DMEM/F12中加入胰岛素样生长因子IGF、碱性成纤维细胞生长因子bFGF、表皮生长因子EGF配置而成，所述原代细胞培养基含IGF的终浓度为20ng/mL，bFGF终浓度为20ng/mL，EGF终浓度为20ng/mL。

6.根据权利要求4所述的原代肿瘤细胞分离培养方法，其特征在于，步骤b)中，所述原代细胞超低粘附培养皿的铺制方法如下：

将聚甲基丙烯酸2-羟乙脂Poly-HEMA溶解于纯乙醇中得到Poly-HEMA胶，其中所述Poly-HEMA胶中Poly-HEMA的终浓度≥20mg/mL；将配置好的Poly-HEMA胶覆盖于培养皿底部，吸干残余胶，放置于细胞培养超净台中紫外照射，吹风过夜至完全干燥，制备得到所述原代细胞超低粘附培养皿。

7.权利要求6所述的原代肿瘤细胞分离培养方法，其特征在于，所述Poly-HEMA胶中Poly-HEMA的终浓度为20～100mg/mL。

8.权利要求6或7所述的原代肿瘤细胞分离培养方法，其特征在于，所述Poly-HEMA胶中Poly-HEMA的终浓度20mg/mL。

9.根据权利要求4所述的原代肿瘤细胞分离培养方法，其特征在于，步骤c)培养的方法为：将步骤b)无血清培养的原代细胞球离心收集细胞，加入含0.25％EDTA的胰蛋白酶消化液消化成单个细胞，放置普通细胞培养瓶中按照传统的细胞培养方法培养。