[发明专利]一种原代肿瘤细胞分离培养方法

说明书

一种原代肿瘤细胞分离培养方法，包括如下步骤：将肿瘤标本去除肿瘤组织周围的坏死及非肿瘤组织，剪碎、消化，所得消化后组织经筛网过滤、离心后PBS重悬，再经离心，弃上层清液，得分离后的组织细胞；将分离后的组织细胞用原代细胞无血清培养基重悬得到重悬液，调整细胞密度，接种于原代细胞超低粘附培养皿中培养；每隔48小时，离心收集细胞后弃掉原有的原代细胞无血清培养基上清，再用原代细胞无血清培养基重悬换液，继续在原代细胞超低粘附培养皿中培养至1周以上，再经常规细胞培养方法培养得到高纯度的原代肿瘤细胞。本发明制备的细胞获得率高，纯化程度高，且对现有实验设备没有更高的要求，适宜在肿瘤研究领域广泛应用推广。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种原代肿瘤细胞分离培养方法。

背景技术

肿瘤侵袭转移等是一个多步骤、多因素、连续进展性的过程。在肿瘤的生长、演进过程中，由于自身遗传的不稳定性和体内外环境的选择压力，细胞会出现不断变异，导致其表型的多样化，而一个实体肿瘤组织或细胞系正是由这些生物学性状不同的细胞亚群所组成。肿瘤在侵袭转移等性状方面的异质性主要表现为，在一个恶性肿瘤的细胞群体中，并非所有的肿瘤细胞均具有侵袭和转移能力，仅某些特殊的细胞亚群才具有这种潜能，而且在这些具有侵袭转移等潜能的细胞亚群中，它们各自的侵袭转移等能力也不一致。从肿瘤组织中建立相应的肿瘤细胞系，对寻找决定侵袭转移等性状的分子机制及侵袭转移等相关基因等具有重要意义。

但是值得注意的是，现有的肿瘤原代细胞均存在非肿瘤细胞污染的情况，例如在肿瘤原代培养过程中全程采用了培养基+胎牛血清的培养模式，在该培养模式下，肿瘤细胞及非肿瘤细胞都可以快速的增殖，即使采用了密度梯度离心法分离不同密度的细胞，但仍然难以将非肿瘤细胞如成纤维细胞清除，最后导致获得纯化的肿瘤细胞纯度低。由于非肿瘤细胞的存在，获得的原代肿瘤细胞即使用于肿瘤细胞生物学及分子生物学实验，其结果可能产生偏倚，使实验结果的可靠性和可重复性降低，影响后续研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种原代肿瘤细胞分离培养方法，解决了人原代肿瘤细胞的分离获得率较低、纯度低等问题，制备的原代肿瘤细胞获得率高，纯化程度高，且对现有实验设备没有更高的要求，适宜在肿瘤研究领域广泛应用推广。

为达到上述目的，本发明的技术方案是：

本发明通过非肿瘤细胞无法在无血清培养条件下生存的特点，建立了一种新的分离、纯化原代肿瘤细胞的方法，这种方法可以广泛应用于各种组织来源的肿瘤培养，为高效获得纯化的原代肿瘤细胞提供了新的技术手段。

本发明所述的一种用于原代细胞培养的原代细胞超低粘附培养皿，其铺制方法如下：

(1)将聚甲基丙烯酸2-羟乙脂(Poly(2-hydroxyethyl methacrylate，Poly-HEMA)溶解于纯乙醇中得到Poly-HEMA胶，其中所述Poly-HEMA胶中Poly-HEMA的终浓度≥20mg/mL；

(2)用移液器将配置好的Poly-HEMA胶覆盖于培养皿底部，吸干残余胶，放置于细胞培养超净台中紫外照射，吹风过夜至完全干燥；将制备好的培养皿收纳入无菌容器中备用。

优选的，所述Poly-HEMA胶中Poly-HEMA的终浓度为20～100mg/mL。

更优选的，所述Poly-HEMA胶中Poly-HEMA的终浓度为20mg/mL。

本发明所用的聚甲基丙烯酸2-羟乙脂(Poly-HEMA)可通过市售方式购买得到，例如Sigma公司产品(25249-16-5)。