[发明专利]用于CRISPRi系统的质粒、其构建方法及其在使鼠疫菌目的基因定向沉默中的应用

权利要求书

1.一种作为鼠疫耶尔森氏菌目的基因定向沉默工具的CRISPRi系统，其包含sgRNA表达质粒和pdCas9-tetO质粒；其中：

所述sgRNA表达质粒包含合成片段pgtet，该合成片段pgtet替换pgRNA载体原有的P_J23119启动子；

其中所述合成片段pgtet包含：P_J23119启动子、由P_J23119启动子启动表达的tetR基因和四环素启动子P_LtetO-1；其中所述四环素启动子P_LtetO-1含有两个tetO元件；

所述pdCas9-tetO质粒为包含具有两个tetO元件的四环素启动子P_LtetO-1的质粒，该四环素启动子P_LtetO-1替换pdCas9载体原有的tetR基因、tetR基因的启动子和四环素启动子。

2.根据权利要求1所述的CRISPRi系统，其特征在于，所述合成片段pgtet的序列为SEQID NO:23所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的CRISPRi系统，其特征在于，所述sgRNA表达质粒的构建方法包括：

构建载体pgRNA-tetO-JtetR：利用限制性核酸酶EcoR I与Hind III对载体pgRNA与合成片段pgtet分别进行酶切，再用T4连接酶对两个酶切片段进行连接；

构建靶向目的基因的sgRNA表达质粒：利用Golden-gate法，将目的基因对应的引物对进行退火处理得到退火产物，利用限制性核酸内切酶Bbs I对所述载体pgRNA-tetO-JtetR和所述退火产物分别进行酶切，用T4连接酶对两个酶切片段进行连接。

4.根据权利要求3所述的CRISPRi系统，其特征在于，所述目的基因对应的引物对分别为：

对应目的基因phoP的SEQ ID NO:1-2；

对应目的基因slyA的SEQ ID NO:3-4；

对应目的基因hmsH的SEQ ID NO:5-6；

对应目的基因cobB的SEQ ID NO:7-8；

对应目的基因pla的SEQ ID NO:9-10；

对应目的基因ail的SEQ ID NO:11-12；

对应目的基因cspB的SEQ ID NO:13-14；

对应目的基因ibpB的SEQ ID NO:15-16；

对应目的基因hdeD的SEQ ID NO:17-18；或

对应目的基因yscB的SEQ ID NO:19-20。

5.根据权利要求1所述的CRISPRi系统，其特征在于，所述pdCas9-tetO质粒的构建方法包括：

将SEQ ID NO:24-25所示的引物对进行退火处理得到退火产物，利用限制性核酸酶AatII与Bgl II对载体pdCas9与所述退火产物分别进行酶切，再用T4连接酶对两个酶切片段进行连接。

6.权利要求1-5中任一项所述的CRISPRi系统在作为鼠疫耶尔森氏菌目的基因定向沉默工具中的用途，其特征在于，将所述sgRNA表达质粒和所述pdCas9-tetO质粒转化入鼠疫耶尔森氏菌中在诱导剂存在下使目的基因定向沉默，其中所述目的基因定向沉默为可逆诱导沉默。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述诱导剂为脱水四环素盐酸盐，所述诱导剂的浓度不低于0.02μg/ml。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述诱导剂的浓度为1μg/ml。

9.根据权利要求6-8中任一项所述的用途，其特征在于，所述转化通过电击转化，所述电击的电压为2.5kV；和/或

所述使目的基因定向沉默的表型包括：抑制鼠疫耶尔森氏菌生物膜的形成。