[发明专利]用于CRISPRi系统的质粒、其构建方法及其在使鼠疫菌目的基因定向沉默中的应用

说明书

本发明公开了一种用于CRISPRi系统的质粒、其构建方法及其在使鼠疫菌目的基因定向沉默中的应用，属于基因编辑技术领域，其中质粒包含sgRNA表达质粒和pdCas9‑tetO质粒，将本发明构建的双质粒CRISPRi系统转化入鼠疫耶尔森氏菌中在诱导剂脱水四环素盐酸盐存在下可使目的基因定向沉默。本发明的CRISPRi系统可以大幅度降低目的基因的转录水平与蛋白水平，并使鼠疫菌表现出缺失目的基因的相关表型，能作为在鼠疫菌中进行高通量基因功能研究的新型工具。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其属于基因编辑技术领域，具体涉及用于CRISPRi系统的质粒、其构建方法及其在使鼠疫菌目的基因定向沉默中的应用。

背景技术

鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis，以下也称鼠疫菌)是自然疫源性烈性传染病-鼠疫的病原菌。远在2000年前即有鼠疫疫情的记载，曾引发三次世界范围内的大流行，给人类带来了巨大的灾难。

鼠疫是我国法定的甲类传染病，同时鼠疫菌也是传染性强、致病性高的A类生物战剂之一。随着防疫水平的提高，鼠疫发病率得到了控制，但是在治疗方面，除了大剂量应用抗生素外尚无其他有效的治疗手段，且仍没有能针对鼠疫耶尔森菌的疫苗问世。虽然近年来对鼠疫菌基因组功能研究有很大进展，但是仍有1000多个基因尚不清楚其具体功能及其在感染宿主过程中的作用。因此进一步从基因水平认识鼠疫耶尔森氏菌及其致病机制仍然是当前攻克鼠疫的一大难关。

CRISPR/Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-Cas)系统是由存在部分细菌与古细菌中一段成簇规律间隔的短回文重复序列与序列附近能够编码具有核酸酶结构域的一系列基因组成的，靶向切断外源DNA发挥适应性免疫防御作用。根据原理将Ⅱ型CRISPR/Cas系统改造，得到CRISPR/Cas9系统，其借助发挥酶切作用的Cas9蛋白与人工合成的sgRNA(single guide RNA)来实现目的基因编辑。

CRISPR/Cas9技术现在已经成为国内外实验室中研究基因功能的一种常用工具，其不仅可以靶向敲除目的基因，也可以实现基因的插入及修改。在对鼠疫耶尔森氏菌的研究中，传统基因敲除技术都是基于同源重组原理的基因敲除技术，近些年有报道证实了CRISPR/Cas系统在鼠疫菌中应用的可行性(Yan,M.Y.,Yan,H.Q.,Ren,G.X.,Zhao,J.P.,Guo,X.P.,Sun,Y.C.(2017).CRISPR-Cas12a-Assisted Recombineering inBacteria.Appl Environ Microbiol,83(17).)，这些基因编辑技术可以实现鼠疫菌中的基因敲除，对其基因组进行修改编辑，虽然可以用于研究鼠疫菌的基因功能，但存在操作复杂，效率低下，且不可逆等缺点。因此，在鼠疫耶尔森氏菌的研究中，亟需一种操作更加简便、更加适合高通量操作的基因编辑技术，以有效研究鼠疫耶尔森氏菌的基因功能和调控基因的表达，有助于更深入认识鼠疫耶尔森氏菌和开发针对鼠疫耶尔森菌的疫苗。

背景技术部分的内容仅仅是发明人所知晓的技术，并不当然代表本领域的现有技术。

发明内容

为解决现有技术中存在的一个或多个问题，本发明一方面提供一种用于CRISPRi系统的sgRNA表达质粒，所述sgRNA表达质粒包含合成片段pgtet，该合成片段pgtet替换pgRNA载体原有的P_J23119启动子；

其中所述合成片段pgtet包含：P_J23119启动子、由P_J23119启动子启动表达的tetR基因和四环素启动子P_LtetO-1；其中所述四环素启动子P_LtetO-1含有两个tetO元件。

上述sgRNA表达质粒的结构模式图如图1中C幅所示。

上述合成片段pgtet的序列为SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列。