[发明专利]用于石油凝聚的微生物胞外多糖及其纯化方法

说明书

本发明涉及一种能用于石油凝聚的微生物胞外多糖及其纯化方法。本发明采用醇沉法和蛋白酶K‑Sevag法酶解法提取菌株CS07胞外多糖，胞外多糖为浅黄色粉末；分离提取的胞外多糖对石油具有良好的凝聚功能。该微生物多糖的石油凝聚性能解决了石油污染后引起的海洋污染问题，使海洋环境完全恢复，并且为开发微生物修复石油污染产品奠定基础。

技术领域

本发明涉及一种能用于石油凝聚的微生物胞外多糖及其纯化方法。

背景技术

随着石油污染问题的加剧，对于石油降解的研究越来越受到人们的关注。尤其水体发生石油污染，包括石油泄漏、油港码头船舶及进入海洋或其他水体中的陆地石油等，因石油密度较小，可漂浮水体表面，随水体流动而快速扩展，造成污染面积的迅速扩大。目前文献报道较多的微生物治理环境石油污染主要集中在利用微生物降解石油，针对海洋漂浮油膜的污染快速扩散问题，利用微生物代谢物对污染油膜进行生物凝聚回收处理则没有报道。因此，开发能凝聚石油的绿色无公害微生物代谢产品已成为当今的主要研究方向。

发明内容

为弥补现有技术的不足，本发明提供一种用于石油凝聚的胞外多糖及其纯化方法。

一种用于石油凝聚的胞外多糖的纯化方法，包括以下步骤：

S1.采用醇沉法和蛋白酶K-Sevag法酶解法提取菌株CS07胞外多糖粗提液；

S2.将胞外多糖粗提液采用DEAE-52纤维素离子交换层析梯度洗脱进行分离纯化，然后采用Sephadex G150凝胶渗透层析柱进一步对活性组分分离纯化，得到胞外多糖。

进一步的，步骤S2中洗脱剂为去离子水、0.3mol/LNaCl、0.6mol/LNaCl、0.9mol/LNaCl，依次洗脱每个浓度洗脱3个柱体积，流速为1.2mL/min。

更为具体的，所述步骤S1包括：

(1)取在LB培养基30℃，150r/min摇瓶培养7d的菌株CS07发酵液，121℃高压灭菌1h后，在4℃11000r/min离心1h，取上清，向沉淀中加入无菌水摇匀后，重复上述操作，上清液在100℃加热搅拌，浓缩至70mL；

(2)向浓缩液中加入30mL无水乙醇，使乙醇终浓度为30％，密封瓶口，放置于4℃静置过夜，将过夜后的溶液在4℃11000r/min离心30min，弃白色沉淀，收集上清液；

(3)向上清液中加入无水乙醇，使乙醇终浓度达到80％，密封瓶口，放置于4℃静置24h，醇沉24h后瓶中会有沉淀吸附于瓶底，小心倾倒弃去全部上清液，以无菌水溶解沉淀；

(4)向溶液中加入0.1％(w/v)的蛋白酶K，60℃酶解3h后，加入1/5溶液体积的Sevag试剂，搅拌20min；4℃11000r/min离心20min；小心收集上清液，弃去中间白色层及下层试剂；重复加入Sevag试剂，离心，直至有机层无沉淀出现，收集合并上清液作为胞外多糖粗提液。

所述的菌株CS07拉丁文学名为Marinobactermaritimus.分类命名：近海海杆菌。所述的菌株CS07采集于大连新港石油污染海域海底沉积物，富集分离所得。所述的菌株CS07已提交保藏，具体保藏信息如下：

保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；

保藏日期：2016年7月6日；

保藏编号：CGMCC No.12739；