[发明专利]一种利用CRISPR/Cas9系统构建致死基因全身性敲除小鼠模型的方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种利用CRISPR/Cas9系统构建致死基因全身性敲除小鼠模型的方法。本发明包括以下步骤：1)设计高效识别敲除后致死基因PAM区域的sgRNA序列；2)将Cas9的mRNA或蛋白和步骤1)设计的sgRNA混合，将混合物对小鼠二细胞胚胎中的任意一个卵裂球细胞显微注射，注射后胚胎移植，品系基因鉴定，得到致死基因敲除的嵌合体阳性首建鼠；3)阳性首建鼠与野生型鼠配种产生F1代，基因鉴定确认后最终得到致死基因全身性敲除的杂合子F1代鼠，完成可传代繁育的小鼠模型构建。本发明的技术方案与ES细胞基因打靶方式构建致死基因全身性敲除小鼠模型的现有技术相比，操作步骤简单，操作难度低，并且制作周期短，周期仅为4个月左右。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种利用CRISPR/Cas9系统构建致死 基因全身性敲除小鼠模型的方法。

背景技术

全身性基因敲除小鼠模型是研究基因功能中较为普遍的一种方法，广泛运用到目的基因对全身生理或病理的功能研究中。其中，致死基因因为在机体内发挥重要 作用从而受到特别关注。致死基因是指基因功能的缺失导致个体在胚胎期和出生后 死亡的一类基因，包括胚胎期致死性基因和出生后致死基因。致死基因全身性敲除 的小鼠模型必须通过杂合子的形式进行传代繁育。研究预测在小鼠基因中，致死基 因约占23％(Cell,2013,154:452；Nature 2016,537:508)。

基于胚胎干细胞(ES细胞)基因打靶或敲除的方法是构建致死基因全身性敲除 小鼠模型的现有方法，大体包括以下4个步骤：(1)敲除载体设计与构建；(2)敲除ES 细胞筛选；(3)敲除ES细胞囊胚注射得到嵌合体小鼠；(4)由嵌合体小鼠繁殖出生殖 遗传系的致死性基因敲除小鼠。但是，此方法制作步骤繁琐，技术操作难度高，并 且制作周期长，周期为1年以上(Nat Rev Genet,2005,6:507)。

CRISPR/Cas9是一种由RNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的 技术。使用CRISPR系统将Cas9 mRNAs或蛋白和向导RNA显微注射到小鼠受精卵 里，实现基因敲除，从而构建全身性基因敲除小鼠模型。与传统的ES细胞基因打靶 方法相比，该方法的实验周期和材料成本大大缩短和降低，已广泛运用到非致死性 基因全身性敲除的小鼠模型构建中(Cell,2013,153:910)。但是，由于CRISPR/Cas9系 统基因敲除效率高，受精卵显微注射方式通常造成致死性基因全身性敲除的首建鼠 (F0代)无法出生(胚胎期致死性基因)或性成熟前死亡(出生后致死性基因)。性 成熟期后F0代鼠的缺乏限制致死性基因敲除的传代繁育(F1代)。因此，运用 CRISPR/Cas9系统通过受精卵显微注射方式无法实现可传代繁育的致死基因全身性 敲除小鼠模型的构建。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的不足，提供一种可传代繁育的致死基因全身性敲除小鼠模型的制备方法，此方法适用于胚胎期致死性基因和出生后致死性基 因。通过该方法可以简单、快速、高效地获得可传代繁育的致死基因全身性敲除小 鼠。

本发明的具体技术方案如下：

本发明的利用CRISPR/Cas9系统构建致死基因全身性敲除小鼠模型的方法，包 括以下步骤：

1)设计高效识别致死基因PAM区域的sgRNA序列；

2)将Cas9的mRNA或蛋白和步骤1)设计的sgRNA混合，将混合物对小鼠 二细胞胚胎中的任意一个卵裂球细胞显微注射，注射后胚胎移植，品系基因鉴定， 得到致死基因敲除的嵌合体阳性首建鼠；

3)阳性首建鼠与野生型鼠配种产生F1代，基因鉴定确认后最终得到致死基因 全身性敲除的杂合子F1代鼠，完成可传代繁育的小鼠模型构建。