[发明专利]一种制备固定化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的方法

说明书

本发明涉及一种制备固定化的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶的方法。该方法利用钴盐作为载体以共沉降法自组装制备得到固定化的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶。本发明的固定化DPEase制备方法具有操作简单、固定化效率高、固定化后的酶不易脱落以及可重复使用等特点。本发明还涉及由上述方法制备的固定化DPEase以及利用该固定化DPEase制备D‑阿洛酮糖的方法。通过本发明的方法制备的固定化DPEase较游离酶的酶活有显著提高，可用于包括制备D‑阿洛酮糖在内的食品加工行业，具有很大的工业应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及制备固定化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的方法以及所制备的固定化DPEase及其应用。

背景技术

稀少糖是指在自然界存在但含量极少的一类单糖及其衍生物，所述稀少糖包括D-阿洛酮糖。D-阿洛酮糖由于其甜度为蔗糖的70％，而热量值只有蔗糖的1％；并且可以用于修饰药物或活性物质，从而优化所述药物或活性物质的功能，在食品和医疗领域有很大的潜在价值。

D-阿洛酮糖在自然界中主要存在于小麦、鼠刺植物、加工过的甘蔗和甜菜糖蜜中，其不能被人消化，是一种低能量且降血糖的食糖替代品。

D-阿洛酮糖是D-果糖的差向异构体，D-果糖在加热条件下可以生成少量的D-阿洛酮糖，为了提高产率，目前常用的方法为生物转化法。

生物转化法中，一种方法是采用氧化还原酶将蒜糖醇氧化为D-阿洛酮糖，但由于其底物蒜糖醇价格昂贵，不具有广泛应用潜力。

另一种是采用异构酶，例如D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(D-psicose3-epimerase，缩写为DPEase)将D-果糖异构化为D-阿洛酮糖，此反应成本低，原料来源广，且转化过程中无任何副产物，非常适合工业化生产D-阿洛酮糖。通常，可利用载体来对D-阿洛酮糖-3-差向异构酶进行固定化，以通过为酶提供稳定的环境，来提高酶的活性。例如，中国专利文献CN102869783A公开了一种阿洛酮糖-差向异构酶的固定化以及使用所述阿洛酮糖-差向异构酶制备D-阿洛酮糖的方法，该方法使用海藻酸钠作为载体来进行阿洛酮糖-差向异构酶的固定化，以对酶进行促活化。然而，使用海藻酸钠作为载体对D-阿洛酮糖-3-差向异构酶进行固定化的缺点在于，海藻酸钠强度低、易碎，不适合工业化应用过程。

中国专利文献CN105849260A报道了一种编码阿洛酮糖差向异构酶的多核苷酸和使用其生产阿洛酮糖的方法，并公开了金属离子(例如钴离子)的存在能够促进阿洛酮糖的产量提高。虽然经研究，D-阿洛酮糖-3-差向异构酶在适量添加钴离子后，酶的活力可以提升到1.6倍，但对将含有钴离子的钴盐作为载体用于D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的固定化及其相关方法，尚缺乏深入研究。

发明内容

因此，本发明的目的是提供简单有效的制备固定化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(也称为“固定化DPEase”)的方法、所制备的固定化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶及其应用，从而解决了现有技术中存在的上述问题。

本发明人研究发现，通过利用钴盐与磷酸缓冲液中的磷酸盐形成的骨架(即磷酸钴)作为载体制备的固定化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶，既能提高酶的重复使用性和稳定性，又能大幅度提高酶的活性。因此，本发明提供了一种利用金属钴离子通过共沉淀法制备固定化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的方法，与游离DPEase和通过使用海藻酸钠作为载体得到的固定化DPEase相比，通过本发明的方法制得的固定化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的稳定性和酶活更高，应用性更好，适合工业生产用。

本发明的第一方面在于提供一种制备固定化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的方法，所述方法包括：

(1)将D-阿洛酮糖-3-差向异构酶溶于磷酸缓冲液中，制备得到含D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的溶液；