[发明专利]一种胰岛细胞低温保存液及其使用方法

权利要求书

1.一种胰岛细胞低温保存液，其特征在于，是在基本培养基中添加：

间充质干细胞条件培养基10-40%；

人血白蛋白 10-50%；

β-氨基乙磺酸1-10mM；

二甲基亚砜 0.1-10%；

4-羟乙基哌嗪乙磺酸1-20mM；

SD-282 1nM-50uM；

6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸1-20mM；

4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐0.1-1.0mM；

间充质干细胞正常培养至细胞融合90%时，通过饥饿或者缺氧处理48-72h后，收集细胞上清液，过滤去除死亡细胞、细胞碎片和凋亡小体，获得含有外泌体的间充质干细胞条件培养基；所述的低温保存液的保存温度为0-4℃。

2.根据权利要求1所述的胰岛细胞低温保存液，其特征在于，是在基本培养基中添加：

间充质干细胞条件培养基15-30%；

人血白蛋白 20-40%；

β-氨基乙磺酸2-5mM；

二甲基亚砜1-5%；

4-羟乙基哌嗪乙磺酸5-10mM；

SD-282 100nM-10uM；

6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸5-10 mM；

4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐0.5-1mM。

3.根据权利要求2所述的胰岛细胞低温保存液，其特征在于，是在基本培养基中添加：

间充质干细胞条件培养基30%；

人血白蛋白 20%；

β-氨基乙磺酸3mM；

二甲基亚砜1%；

4-羟乙基哌嗪乙磺酸5mM；

SD-282 1uM；

6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸5mM；

4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐0.5mM。

4.根据权利要求1所述的胰岛细胞低温保存液，其特征在于，基本培养基包括：F10，EGM-2，或RPMI1640培养基。

5.根据权利要求4所述的胰岛细胞低温保存液，其特征在于，基本培养基中添加有：10-30%猪血清、1-20mM谷氨酰胺、1-15mM尼克酰胺、10-50mM甘露醇、0.5-5mM半胱氨酸、10-500µM维生素C。

6.根据权利要求1所述的胰岛细胞低温保存液，其特征在于，间充质干细胞条件培养基的制备过程如下：取P3-5代间充质干细胞置于37℃、体积分数为 5% CO₂培养箱中培养，加入含体积分数为10% 猪血清的RPMI1640培养基，每3天换一次液；待细胞贴壁面积超过90%时，弃培养基，PBS洗涤2次后加入不含血清的RPMI1640培养基继续培养48h；用移液器将培养皿内培养基转移至50ml离心管内，300×g离心10min去除悬浮细胞；用移液器将上清转移至新的离心管内2000×g离心10min，去除死亡细胞、细胞碎片、凋亡小体，上清过0.22um滤器获得间充质干细胞条件培养基；-80°C冷冻保存备用；使用前选用不同批次冻存条件培养基混合使用，以剔除个体差异。

7.权利要求1-6任一项所述的胰岛细胞低温保存液的使用方法，其特征在于，保存温度为0-4℃，胰岛细胞浓度为5000-10000IEQ/1-5mL保存液。

8.根据权利要求7所述的胰岛细胞低温保存液的使用方法，其特征在于，保存时间为5天。

9.根据权利要求7所述的胰岛细胞低温保存液的使用方法，其特征在于，所述的低温保存液针对猪胰岛细胞。