[发明专利]一种胰岛细胞低温保存液及其使用方法

说明书

本发明公开了一种胰岛细胞低温保存液及其使用方法。该低温保存液是在基本培养基中添加：间充质干细胞条件培养基10‑40％、人血白蛋白10‑50％、β‑氨基乙磺酸1‑10mM、二甲基亚砜0.1‑10％、4‑羟乙基哌嗪乙磺酸1‑20mM、SD‑282 1nM‑50uM、6‑羟基‑2,5,7,8‑四甲基色烷‑2‑羧酸1‑20mM、4‑(2‑氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐0.1‑1.0mM。该低温保存液能够达到在不影响胰岛细胞各项功能指标的前提下延长低温保存时间，以满足胰岛细胞短期长距离运输的目的。

技术领域

本发明属于动物胰岛细胞低温保存技术领域，具体涉及一种可用于胰岛细胞低温运输保存液及其使用方法。

背景技术

2017年国际糖尿病联盟(IDF)发布了第八版全球糖尿病地图。新版地图显示，目前全球有4.25亿糖尿病患者，预计到2045年，将会有近7亿糖尿病患者。虽然采用强化血糖控制方案能控制糖尿病高血糖的发生，但不能防止低血糖的发生，也不能阻止糖尿病并发症的发生，终末期糖尿病患者由于存在着多器官损伤的并发症发生，需要耗费巨额医疗费用进行治疗，使大量家庭由此陷入严重的贫困状况，20％糖尿病并发症患者不能承受巨额医疗费用，因放弃治疗而导致死亡。因此，异种移植胰岛细胞治疗糖尿病研究蓬勃发展，日前取得了可喜的疗效。临床级猪胰岛细胞制品如何在全球范围内安全运输，也成了胰岛细胞产业化需要解决的关键问题。

体外培养(37℃)是目前公认的短期保存胰岛的最佳方法，原因在于通过体外培养可以提高胰岛细胞团的整体质量，如降低其免疫原性(Markmannet al.,1990；Jahret al.,2002)；纯化胰岛细胞团(Weberet al.,1977)等。但据报道称，这种方式的最长保存时间仅为48h(Heringet al.,2004)，且经过一段时间的体外培养，胰岛的数量会损失近总数的一半(Kin et al.,2008；Noguchiet al.,2010)，更为关键的是，通过这种方式保存的细胞在长途运输过程中也存在很大的问题，如胰岛细胞团的再次损失；培养环境要求过高、单位体积内保存的细胞密度小而导致的高运输成本等。

为了解决这些问题，考虑以超低温保存(cryopreservation)或低温保存(hypothermic preservation)等方式储存及运输胰岛细胞团。在超低温条件(-196℃)下，细胞将长期处于一个生命结构完整但新陈代谢缓慢甚至停滞的状态，可以进行长时间的储存，且在这种条件下细胞保存的密度相对与体外培养将大幅度提高。但通过超低温保存的胰岛细胞团，在降温和复温的过程中极易受胞内外冰晶的产生(McGann et al.,1988)、渗透压的急剧变化(osmotic rupture)(Toneret al.,1993)等因素的影响而损伤，尤其是在0～-60℃这段温度范围内。而且高浓度的冻存保护剂(cryoprotective agents,CPAs)，对细胞的活率及功能也存在一定的毒害作用(Best,2015)。

而在低温条件(0～4℃)下，细胞的代谢、能量储存及耗氧量均会降低，使其有短期储存的可能性，且低温保存不需要特殊的、价格高昂的超低温设备，因此，低温保存是最有可能实现胰岛细胞产业化运输的方式。但在这种温度条件下会引发如细胞膜及骨架受损(Stefanovich et al.,1995)、胞内离子失衡(Boutilier,2001)、氧化还原失衡(Vairettiet al.,2005)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)缺失(Brinkkoetteret al.,2008)等一系列的细胞损伤，且随着低温保存时间和复苏时间的延长这些损伤会逐渐加剧，最终导致细胞大量死亡。

因此，提高细胞活性、减轻细胞损伤，成了胰岛低温保存前进道路上必须解决的核心问题。除调节细胞密度(Paherniket al.,1996)和培养基内氧含量及增加培养基循环(Hart et al.,2005)外，最为有效的抑制细胞损伤的方法就是筛选合适的低温保存液和保护剂(Umeshitaet al.,1988；Todoet al.,1989；Shaninaet al.2000；Fenget al.,2006)。