[发明专利]一种诱导体细胞胚直接发生的方法和应用

说明书

本发明公开了一种诱导体细胞胚直接发生的方法和应用，本发明发现了能够促进植物体细胞胚发生的功能基因RID3(AT3G49180)和YUC10(AT1G48910)。通过异位表达上述功能基因，不经过愈伤组织，能够直接在拟南芥子叶上诱导形成体细胞胚。本发明的诱导体细胞胚直接发生的方法，具有培养简易、诱导周期短、诱导频率高等优势，可用于植物细胞的分化、发育、全能性表达和作物品种改良、人工种子的生产、优质种质资源的保存、突变体筛选等方面的研究。

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种诱导体细胞胚直接发生的方法和应用。

背景技术

被子植物从双受精形成合子开始到胚胎发育成熟变成种子，这个发育过程先后经历了合子激活，细胞的分裂分化、极性的建立、模式的形成和器官的形成等，并且胚胎的发育是受到精确的遗传调控的。受精前的卵细胞在代谢上相对静止，只有在与精细胞融合之后，才能被激活从而启动胚胎发育的过程(蒋丽等，2007)。体细胞胚的起始却与此不同，植物体细胞胚胎发生(somatic embryogenesis)是指植物体细胞在未经性细胞融合的情况下，模拟有性的合子胚胎发生而发育形成一个新个体的形态发生过程，它不需要经过双受精的过程，可以由体细胞直接发育而来，但这个过程可能需要特定的培养条件、激素环境、或者是分子调控等因子作为起始信号。除胡萝卜体细胞胚的诱导外，很多植物的小孢子可以去分化并经胚胎发生途径形成单倍体植株，这一过程称为花粉胚胎发生。当小孢子受到饥饿或高温等外界环境胁迫时，配子体发育就会停滞，新的发育模式形成，此时将小孢子转移到正常环境，它会持续分裂，最终形成体细胞胚(Touraev and Heberle-Bors,1999)。20世纪90年代起，拟南芥体细胞胚胎发生体系已经开始建立并随后逐步完善。拟南芥叶片原生质体能够诱导体细胞胚的产生，但是在球形胚早期体细胞胚的发育终止(Luo and Koop,1997；O’Neill and Mathias,1993)。Sangwan(1992)和Wu(1992)等报道了以未成熟合子胚作为外植体首先诱导胚性愈伤组织的产生，进而诱导体细胞胚胎发生(Sangwan et al.,1992；Wu et al.,1992)。在这个系统中，从合子胚诱导获得的体细胞胚可以发育成为完整植株，而合子胚外植体的发育时期对于诱导愈伤组织的形成和体细胞胚胎发生至关重要(Wu et al.,1992)。2002年，Ikeda-Iwai等人又修改了上述培养体系(Ikeda-Iwai et al.,2002)。在新体系中，合子胚外植体首先诱导产生初级体细胞胚，然后在液体培养基中悬浮培养产生胚性细胞团，进而诱导产生次级体细胞胚。这种液体培养系统不仅提高了胚性细胞的增殖速率，还增加了次级体细胞胚的数量。

一般而言，体细胞胚的产生需要激素的诱导，通常利用生长素或细胞分裂素来诱导。依此而论，体细胞胚的发生需要经过两个过程：首先，是在生长素的作用下获得形成体细胞胚的能力；其次，是去除生长素后体细胞胚的形成。当然，还存在另一条诱导体细胞胚的途径，就是通过异位表达特定的拟南芥基因来诱导体细胞胚的发生。在拟南芥中，LEAFYCOTYLEDON(LEC)基因家族的LEC1、LEC2、FUSCA 3(FUS3)在胚胎的发生过程中具有重要的作用，它们突变体的表型均为子叶具有真叶的特征。LEC1特异的在胚胎中表达，过表达LEC1致使幼苗仍保持胚胎特性，如：子叶无法张开，根也无法伸长，在茎端分生组织处形成类似胚胎的结构等(Lotan et al.,1998)。LEC2和FUS3是VIVIPAROUS1/ABSCISIC ACIDINSENSITIVE 3-LIKE B3(VP1/ABI3-like B3)家族的转录因子(Luerssen et al.,1998；Stone et al.,2001)，通过蛋白序列比对可知，LEC2和FUS3具有43％的同源性。异位表达LEC2基因可以促进体细胞胚的发生，致使体细胞向胚性细胞发生转变(Stone et al.,2001)。植物通过体细胞胚胎发生途径形成再生植株已是极其普遍的现象。