[发明专利]一种基因合成的方法

说明书

本发明提供一种基因合成的方法，所述方法包含将多种靶基因分割成若干个重叠寡核苷酸序列，在重叠寡核苷酸序列的端部添加酶切位点序列和标签序列，所述标签序列因不同的靶基因而不同；使连接有标签序列的重叠寡核苷酸序列以单链形式与连接有标签序列的反向互补序列的磁珠通过双链结构特异性连接，然后在油包水体系中酶切得到单链的重叠寡核苷酸，再进行聚合酶链式组装，同时获得多种靶基因片段。

技术领域

本发明涉及一种基因合成的方法，具体涉及一种同时合成多个不同基因的方法。

背景技术

基因合成是现代生物技术持续快速发展的重要使能技术，能否以更低的成本更高的通量获得价格更低的基因非常关键。近年来基于芯片的DNA合成技术得以快速发展，使得科研人员能够以非常低廉的价格获得大量DNA序列。同时，与之对应的也有一些DNA合成技术被开发出来，能够利用这些价格低廉的DNA文库进行基因合成(Large-scale de novoDNA synthesis:technologies and applications,Nat Methods.2014May；11(5):499-507)。但是，到目前为止，大部分的技术都需要做depooling，之后将目的基因分别合成出来，这会带来比较高的下游处理成本。

2018年，Sriram Kosuri团队开发了一种多元基因合成的方法(Multiplexed genesynthesis in emulsions for exploring protein functionallandscapes.Science.2018Jan19；359(6373):343-347)，该方法通过精巧的oligo文库设计，使得不同基因的合成引物能够被磁珠吸附进入不同的微球，从而能够将不同的基因在同一个PCR反应体系中进行合成。然而该方法的引物设计过程含有两次酶切的步骤，致使整个流程特别繁琐；同时，单条引物的设计需要分别对两个酶切位点加入两次，致使引物长度的利用率很低；另外，该方法不能用来合成序列中含有这两个酶位点的序列，致使方法的应用非常有限，而且下游处理的流程过于复杂，限制了这个方法的广泛应用。

发明内容

本发明提供了一种多基因合成方法，所述方法包括：

(1)将待合成的多种靶基因片段中的每种靶基因片段分割成若干个重叠寡核苷酸序列，在每个重叠寡核苷酸序列端部加上修饰序列使其能够以单链形式与磁珠特异性连接，所述修饰序列包括酶切位点序列和标签序列，所述标签序列因不同的靶基因片段而不同；

(2)合成带有修饰序列的重叠寡核苷酸序列；

(3)使带有修饰序列的重叠寡核苷酸序列与磁珠特异性连接；所述磁珠上连接有标签序列的反向互补序列，所述的特异性连接是通过标签序列与其反向互补序列形成双链结构；

(4)通过酶切得到单链的重叠寡核苷酸序列，再进行聚合酶链式组装(PCA)，获得多种靶基因片段；

其中，所述酶切和聚合酶链式组装在油包水体系中进行。

在一些实施方案中，至少一个油包水体系的每个油包水体系中仅中包含一个磁珠。

在一些实施方案中，在酶切之前加入酶切和PCA反应所需的缓冲液和试剂，并将其加入到油性介质中，震荡形成油包水体系。

在一些实施方案中，每个靶基因片段两端具有通用引物。

在一些实施方案中，所述酶切是通过内切酶进行切割，所述内切酶优选BspQI酶。

在一些实施方案中，所述的标签序列含有10-100个碱基，优选15-70个碱基，更优选20-40个碱基，最优选20-30个碱基。

在一些实施方案中，每一个重叠寡核苷酸序列含40-150个碱基；优选50-130个碱基；更优选60-110个碱基；再优选65-90个碱基；最优选65-80个碱基。