[发明专利]一种DNA组装的方法及其应用

权利要求书

1.一种质粒，其特征在于，包含单个毗邻的IIP和IIS型限制性内切酶识别位点。

2.根据权利要求1所述的质粒，其特征在于，所述IIP型限制性核酸内切酶为切割产生两个及以上碱基粘性末端的IIP型限制性内切酶。

3.根据权利要求1所述的质粒，其特征在于，

所述IIS型限制性内切酶为切割产生单碱基粘性末端的IIS型限制性内切酶；或

为切割产生平末端的IIS型限制性内切酶。

4.根据权利要求3所述的质粒，其特征在于，所述IIS型限制性内切酶为BmrI、BciVI、HphI或MlyI。

5.一种DNA组装的方法，其特征在于，包括：

(1)待插入基因的单端连接含有毗邻IIP和IIS型限制性核酸内切酶识别位点的DNA片段以获得目的基因；

(2)采用相应的IIP型限制性核酸内切酶剪切所述目的基因以获得供体DNA；

(3)采用相应的IIP和IIS型限制性核酸内切酶剪切所述权利要求1-3任一项所述质粒以获得受体DNA，所述质粒包含与所述目的基因相同的IIP和IIS型限制性核酸内切酶识别位点；

(4)连接所述供体DNA和所述受体DNA。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述目的基因中，IIP型限制性核酸内切酶识别位点在IIS型限制性核酸内切酶识别位点的外侧。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，当所述IIS型限制性核酸内切酶为切割产生单碱基粘性末端的IIS型限制性内切酶时，步骤(1)还包括在所述待插入基因的另一端连接一个A碱基。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，先使用相应的IIP型限制性核酸内切酶剪切所述质粒以获得线性化质粒，再使用相应的IIS型限制性核酸内切酶剪切所述线性化质粒。

9.一种重组菌，其特征在于，根据权利要求5-8任一项所述的方法构建。

10.根据权利要求9所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌为生产苏氨酸的重组菌，与所述出发菌相比具有提高的天冬氨酸激酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合成酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、苏氨酸外排转运蛋白的表达，与所述出发菌相比具有降低的苏氨酸脱氢酶、苏氨酸脱水酶的表达，

通过使用携带相应基因的质粒转化至所述出发菌来实现所述表达的提高，通过敲除所述出发菌的相应基因来实现所述表达的降低，

采用权利要求5-8任一项所述的方法构建所述携带相应基因的质粒，采用利要求5-8任一项所述的方法构建用于敲除所述相应基因的载体。