[发明专利]用于检测乳铁蛋白的ELONA适配体及其应用

说明书

本发明涉及乳铁蛋白的核酸适配体对乳铁蛋白质的ELONA检测方法及试剂盒。进一步地，本发明涉及的试剂盒包含针对乳铁蛋白不同免疫位点识别的两条核酸适配体。另一方面，本发明涉及针对乳铁蛋白不同免疫位点识别的两条核酸适配体在用于检测乳铁蛋白的ELONA试剂盒中的用途。

技术领域

本发明设计使用核酸适配体来检测乳铁蛋白的ELNOA方法和试剂盒。进一步地，本发明涉及检测牛奶、奶粉等乳制品中的乳铁蛋白的ELONA方法和试剂盒。

背景技术

乳铁蛋白(Lactoferrin，简写为LF)是动物初乳中的天然蛋白质，是一种多功能蛋白质，具有光谱抗菌，抗病毒感染作用，能调节体内铁的平衡。能够促进细胞的生长，调节机体的免疫功能，增强机体抗病能力。乳铁蛋白广泛分布于哺乳动物乳汁中，人乳中乳铁蛋白浓度约为1.0-3.2mg/mL，约是牛乳中的10倍。它被认为是一种新型抗菌、抗癌药物和具有潜力的食品和饲料添加剂，国家食品安全标准GB14880也将其列为营养强化剂。目前市场上常见的乳铁蛋白主要是从牛乳中提取的乳铁蛋白，然后将其添加至配方乳粉、营养食品及保健品等，乳铁蛋白的含量已经成为这些相关产品质量的主要指标。

酶联免疫吸附技术(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)目前广泛应用于蛋白分子的检测。但是传统的基于抗体的ELISA检测技术有一些不足，例如抗体需要使用严格的低温保存条件，抗体的制备周期长、费用高、批间质量差异大，而且使用ELISA检测时还需要使用带有标记的二抗反应，导致操作繁琐。核酸适配体具有与单克隆抗体相当的高特异性和高亲和性，能够便于保存和运输，温度变化引起的变性是可逆的，且筛选时间短、费用低，且重复性高。而且得到的核酸适配体在后期易于合成和修饰。在先前的工作中，我们基于指数富集配体进化技术，以乳铁蛋白为靶标进行筛选，获得了一对可以高特异性、高亲和识别乳铁蛋白不同免疫位点的核酸适配体。

发明内容

为了克服现有基于抗体检测乳铁蛋白的酶联免疫吸附技术的不足，本发明的目的是提供一种高特异性、高灵敏度、操作便捷的核酸适配体的酶联寡核苷酸分析(Enzyme-linked oligonucleotide assay,ELONA)检测乳铁蛋白的方法。

用于检测乳铁蛋白的ELONA适配体，包括SEQ ID NO.1～2所示的核苷酸序列。

其中，SEQ ID NO.1～2所示的核苷酸序列的3’端利用生物素标记。

一种用于检测乳铁蛋白的ELONA方法，该方法包括以下步骤：

(1)获得待测样品；

(2)将包被缓冲液加入固体支持物中过夜孵育；

(3)使用牛血清白蛋白(BSA)进行封闭；

(4)将核酸适配体A加入到封闭处理后的固体支持物中，所述的固体支持物为酶标板，所述酶标板可以选择96孔酶标板，反应，然后清洗3次并将孔拍干；

(5)将待测样品、标准品分别加入固体支持物；并加入核酸适配体B与酶标试剂反应，然后清洗并将孔拍干；

(6)加入100μL显色液避光反应10min，最后加入50μL终止液终止反应，并检测待测样品在450nm处的吸光值，所述显色液为TMB显色液，所述终止液为2M的H₂SO₄；

所述核酸适配体A的序列如SEQ ID NO.1所示；

所述核酸适配体B的序列如SEQ ID NO.2所示；。

步骤(2)中，所述包被缓冲液的配方如下：Na₂CO₃ 1.59g/L，NaHCO₃ 2.94g/L。