[发明专利]一种液态奶中微生物总DNA的提取方法

权利要求书

1.一种液态奶中微生物总DNA的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括以下步骤：

(1)样品处理：室温均质牛奶样品，取1.0mL牛奶样品进行离心，弃掉上清液，得到沉淀物；

(2)细胞裂解：在步骤(1)得到的所述沉淀物中加入Enzymatic Lysis buffer和lysozyme混匀后孵育，得到裂解液；

(3)纯化DNA：在步骤(2)得到的所述裂解液中加入酚氯仿进行抽提，旋涡振荡，直至白色悬浊液出现，室温孵育5min，然后离心取上清液；

(4)回收DNA：在步骤(3)得到的所述上清液中加入Glycogen、醋酸钠和异丙醇，混匀，-20℃孵育30min，离心弃掉上清液，并同时保留沉淀；

(5)溶解DNA：在步骤(4)得到的所述沉淀中加入75％无水乙醇进行洗涤，弃掉上清液，将沉淀室温晾干3-5min；加入20μL TE buffer或者ddH₂O，室温孵育8-10min后，轻弹混匀或者轻微涡旋混匀，即可获得检测样品。

2.根据权利要求1所述的液态奶中微生物总DNA的提取方法，其特征在于，步骤(1)中，将所述牛奶样品室温13000x g离心5min，沉淀样品，弃掉上清液，得到沉淀物。

3.根据权利要求1所述的液态奶中微生物总DNA的提取方法，其特征在于，步骤(2)中，在所述沉淀物中加入500μL的Enzymatic Lysis buffer和1μL的lysozyme混匀后孵育，加入3μL蛋白质K，孵育1h，得到裂解液。

4.根据权利要求3所述的液态奶中微生物总DNA的提取方法，其特征在于，在所述沉淀物中加入500μL的Enzymatic Lysis buffer和1μL的lysozyme混匀后孵育，加入3μL蛋白质K，孵育1h，然后玻璃珠研磨10min，得到裂解液。

5.根据权利要求4所述的液态奶中微生物总DNA的提取方法，其特征在于，在所述沉淀物中加入500μL的Enzymatic Lysis buffer和1μL lysozyme，上下吹打混匀，37℃孵育1h，后，加入3μL蛋白质K到裂解液中，55℃热孵育1h，得到重悬浮液，将所述重悬浮液转移到一个含有0.8-1g玻璃珠子的离心管中振荡10min，得到裂解液。

6.根据权利要求1所述的液态奶中微生物总DNA的提取方法，其特征在于，步骤(3)中，所述上清液中加入1倍体积的酚氯仿进行抽提，旋涡振荡，直至白色悬浊液出现，室温孵育5min，然后在4℃下，16000x g离心10min，取上清液。

7.根据权利要求1所述的液态奶中微生物总DNA的提取方法，其特征在于，步骤(3)中，向步骤(2)得到的所述上清液中加入0.2倍体积的10M醋酸铵，冰上孵育5min，然后在25℃下，13000x g离心10min，取第二次上清液，加入酚氯仿进行抽提，旋涡振荡，直至白色悬浊液出现，室温孵育5min，然后离心取上清液。

8.根据权利要求1所述的液态奶中微生物总DNA的提取方法，其特征在于，步骤(4)中，所述上清液中加入1μL的Glycogen、1/10体积的3M醋酸钠和1倍体积异丙醇，所述醋酸钠的pH为5.2，上下颠倒混匀5-6次，-20℃孵育30min，4℃，16000x g离心15min，弃掉上清液，并同时保持沉淀在离心管中。

9.根据权利要求1所述的液态奶中微生物总DNA的提取方法，其特征在于，步骤(5)中，在所述沉淀中加入新鲜配制的75％无水乙醇洗涤两次，弃掉上清液，将沉淀室温晾干3-5min；加入20μL TE buffer或者ddH₂O，室温孵育8min后，轻弹混匀或者轻微涡旋混匀，即可获得检测样品。

10.根据权利要求9所述的液态奶中微生物总DNA的提取方法，其特征在于，所述洗涤两次具体为：在所述沉淀中加入新鲜配制的75％无水乙醇，上下颠倒混匀使白色沉淀完全漂浮在洗液中，4℃，16000x g离心5min，弃掉上清液，再加入新鲜配制的75％无水乙醇重复洗涤一次，去掉上清液，保留沉淀。