[发明专利]一种液态奶中微生物总DNA的提取方法

说明书

本发明涉及一种液态奶中微生物总DNA的提取方法，所述提取方法包括细胞裂解过程、DNA纯化过程、DNA回收过程和溶解DNA等过程。本发明的有益效果：所述的液态奶中微生物总DNA的提取方法，具有耗时短，步骤少，无裂解液浪费，提取的DNA质量比传统方法更纯，质量更高，提取的DNA量比传统方法更大。

技术领域

本发明涉及一种DNA的提取方法，具体涉及一种液态奶中微生物总DNA的提取方法。

背景技术

液态奶样品中微生物多样性分析日显重要，传统的分离培养技术，菌种形态检测技术等，一方面受到模拟培养环境上的挑战，另一方面受到了准确性及灵敏性的限制。随着高通量测序技术的发展及测序成本的大幅度降低，DNA水平上检测牛奶中微生物的组成，有着高灵敏度，较高准确度的优势。

16S扩增子测序技术是研究环境中原核微生物多样性及群落组成差异的高通量测序技术之一，通过提取环境或者食品样品的DNA，选择合适的通用引物扩增16S的目标区域，通过检测目标区域的序列变异和丰度，来研究微生物多样性分布及差异分布。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种液态奶中微生物总DNA的提取方法，其具有耗时短，提取的DNA质量更纯，更高等特点。

本发明的目的是提供一种液态奶中微生物总DNA的提取方法。

根据本发明的具体实施方式的液态奶中微生物总DNA的提取方法，所述提取方法包括以下步骤：

(1)样品处理：室温均质牛奶样品，取1.0mL牛奶样品进行离心，弃掉上清液，得到沉淀物；

(2)细胞裂解：在步骤(1)得到的所述沉淀物中Enzymatic Lysis buffer和lysozyme混匀后孵育，得到裂解液；

(3)纯化DNA：在步骤(2)得到的所述裂解液中加入酚氯仿进行抽提，旋涡振荡，直至白色悬浊液出现，室温孵育5min，然后离心取上清液；

(4)回收DNA：在步骤(3)得到的所述上清液中加入Glycogen、醋酸钠和异丙醇，混匀，-20℃孵育30min，离心弃掉上清液，并同时保留沉淀；

(5)溶解DNA：在步骤(4)得到的所述沉淀中加入75％无水乙醇进行洗涤，弃掉上清液，将沉淀室温晾干3-5min；加入20μL TE buffer或者ddH₂O，室温孵育8-10min后，轻弹混匀或者轻微涡旋混匀，即可获得检测样品。

其中，TE buffer或者ddH₂O为洗脱缓冲液。得到的检测样品也可以保存于-80℃的冰箱以便后续使用。

根据本发明的具体实施方式的液态奶中微生物总DNA的提取方法，其中，步骤(1)中，将所述牛奶样品室温13000x g离心5min，沉淀样品，弃掉上清液，得到沉淀物。

根据本发明的具体实施方式的液态奶中微生物总DNA的提取方法，其中，步骤(2)中，在所述沉淀物中加入500μL的Enzymatic Lysis buffer和1μL的lysozyme混匀后孵育，加入3μL蛋白质K，孵育1h，得到裂解液。

据本发明的具体实施方式的液态奶中微生物总DNA的提取方法，进一步的，在所述沉淀物中加入500μL的Enzymatic Lysis buffer和1μL的lysozyme混匀后孵育，加入3μL蛋白质K，孵育1h，然后玻璃珠研磨10min，得到裂解液。玻璃珠研磨是玻璃珠的随机碰撞，目的是物理性破坏菌体肽聚糖细胞壁，进一步降解细胞壁。加入玻璃珠后震荡10min，由于剧烈震荡造成试管内有较多气泡，为了避免补液时液体外溢造成交叉污染，可以室温条件下，13000xg离心3min，消除气泡的影响。