[发明专利]一种高通量构建单克隆抗体表达载体的方法

权利要求书

1.一种高通量构建单克隆抗体表达载体的方法，所述的方法包括以下步骤：

(1)分选抗原特异性单B细胞高通量反应容器，并进行逆转录；

(2)以步骤(1)获得的逆转录反应产物为模板，分别进行重链和轻链可变区的PCR扩增；

(3)将重链可变区克隆片段和轻链可变区克隆片段分别重组至表达载体中；所述的表达载体包含自杀基因ccdB。

2.根据权利要求1所述的方法，所述的高通量反应容器为微板形式的实验器具，包括但不限于12孔板，24孔板，48孔板和/或96孔板。

3.根据权利要求1-2任一项所述的方法，所述的步骤(2)的PCT扩增优选为巢式扩增。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，在所述的步骤(2)后还包括纯化和/或回收扩增片段的步骤，优选地，所述的纯化和/或回收操作优选为磁珠法。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，所述的巢式扩增为两轮PCR扩增，优选使用两轮不同的引物，重链和轻链可变区的扩增分别使用重链和轻链扩增引物；每轮重链或轻链扩增引物分别包含正向引物和反向引物。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，所述的表达载体在多克隆位点具有自杀基因ccdB。

7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，所述的表达载体分为重链表达载体和轻链表达载体，所述的重链或轻链表达载体是在人IgG1表达载体的多克隆位点上引入自杀基因ccdB；优选所述重链表达载体还包含信号肽-VH-CH1-铰链区-CH2-CH3的序列；所述的轻链表达载体中还包含信号肽-Vκ-Cκ的序列。

8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，所述的表达还包含启动子序列。

9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，所述的步骤(3)的操作包括：将表达载体做线性化处理得到线性化表达载体；将线性化载体、重链可变区克隆片段或轻链可变区克隆片段和重组试剂反应液混合，连接，得到重组化的表达载体；将重组化的表达载体加入到感受态细胞培养，从扩增后的细胞中提取质粒，获得构建的含重链可变区和轻链可变区的表达载体。

10.一种高通量单克隆抗体表达用于抗体发现的方法，所述的方法除包括权利要求1-9中任一项所述的步骤(1)至(3)外，还包括步骤：(4)高通量瞬转表达人鼠嵌合抗体。