[发明专利]一种高通量构建单克隆抗体表达载体的方法

说明书

本发明涉及一种高通量构建单克隆抗体重组载体的方法以及该方法在高通量抗体发现中的应用，所述的方法包括以下步骤：分选抗原特异性单B细胞到高通量反应容器，并进行高通量逆转录；以获得的逆转录反应产物为模板，分别进行重链和轻链可变区的PCR扩增；将重链可变区克隆片段和轻链可变区克隆片段分别重组至表达载体中；所述的表达载体包含自杀基因ccdB。所述的高通量构建单克隆抗体重组载体的方法可极大地提高重组成功率，从而提高抗体发现的效率，缩短抗体发现时间。

技术领域

本发明属于抗体发现领域，特别涉及一种高通量构建单克隆抗体表达载体的方法以及该方法在抗体发现中的应用。

背景技术

单克隆抗体具有靶点性强、成药性强、副作用小等优点。生物药，尤其是抗体类药已成为药物领域最有活力和前景的一个方向。全球获批抗体有超过80余个，销售额已突破千亿美金。抗体药物研发已构成各大跨国药企和国内药企的主要研发管线。

目前一些方法可获得单克隆抗体，比如小鼠杂交瘤技术、人杂交瘤技术、噬菌体文库技术、EBV转化B淋巴细胞技术等。小鼠杂交瘤技术免疫原性高、半衰期短，临床效果有限；而人杂交瘤技术则具有融合效率低、亚克隆易丢失等缺点，噬菌体文库展示技术则在建库过程中易出现轻重链随机配对的情况，并且研发周期长；EBV转化B细胞技术的抗体产量较低。而单B细胞抗体克隆表达技术可有效解决这些问题，可实现抗原特异性小鼠单克隆抗体的快速克隆和筛选鉴定分析。

单B细胞克隆技术一个难题在于抗体基因的重组的成功率：即在获得大量抗体基因后，如何实现抗体重组载体的高通量克隆和表达，并用于抗体筛选鉴定。传统方法会导致酶切不完全或自连形成空载的问题，严重影响高通量重组成功率；特别是重组后细菌摇菌过夜用于质粒抽提，空载质粒更易被扩增，对下游表达鉴定效率影响巨大。因此，如何有效消除空载是实现高通量重组及表达筛选的技术关键。

申请人发现，在进行高通量抗体克隆和筛选鉴定操作中，在表达载体中引入 ccdB自杀基因，可有效控制空载率，提高克隆重组阳性率，保证获得的克隆皆可高效表达。当此方法用于高通量表达载体制备、抗体的高通量筛选和理化活性鉴定分析等抗体发现技术时，可极大地提高抗体发现的效率。

发明内容

一方面，本发明提供了一种高通量构建单克隆抗体表达载体的方法，所述的方法包括以下步骤：

(1)分选抗原特异性单B细胞高通量反应容器，并进行逆转录；

(2)以步骤(1)获得的逆转录反应产物为模板，分别进行重链和轻链可变区的 PCR扩增；

(3)将重链可变区克隆片段和轻链可变区克隆片段分别重组至表达载体中；所述的表达载体包含自杀基因ccdB。

所述的高通量构建单克隆抗体表达载体的方法可极大地提高重组成功率。

另一方面，本发明还涉及一种高通量单克隆抗体发现的方法，所述的方法包括以下步骤：

(1)分选抗原特异性单B细胞高通量反应容器，并进行逆转录；

(2)以步骤(1)获得的逆转录反应产物为模板，分别进行重链和轻链可变区的 PCR扩增；

(3)将重链可变区克隆片段和轻链可变区克隆片段分别重组至表达载体中；所述的表达载体包含自杀基因ccdB。

(4)高通量瞬转表达人鼠嵌合抗体。

所述的高通量构建单克隆抗体表达载体的方法可极大地提高重组成功率。所述的高通量单克隆抗体发现的方法可极大地提高抗体发现的效率。

在上述两种方法：

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