[发明专利]一种利用金属有机框架材料制备酶标记抗体的方法

说明书

本发明公开了一种利用金属有机框架材料制备酶标记抗体的方法，首先利用金属有机框架材料PCN‑333上的羧基与EDC和sulfo‑NHS发生反应，使PCN‑333功能化，再加入抗体，抗体上的氨基与功能化的PCN‑333发生酰基化反应生成稳定的酰胺键，即抗体被固定到PCN‑333的表面，最后将酶封装到PCN‑333中，形成酶标记抗体复合物。本发明通过抗体与MOFs的偶联反应，避免了繁琐且低效率的酶和蛋白(抗体)的化学交联，通过简单的离心即可使制备的复合物与多余的抗体或者酶分离，避免了繁琐的分离与纯化步骤，如凝胶过滤、长时间透析等，进而保证了酶和抗体的活性不受损失，改变了传统意义上抗体与酶的偶联过程，不仅简化了酶标抗体的过程，而且提高了酶标量，大大地降低了制备酶标记抗体的成本。

技术领域

本发明属于免疫分析技术领域，具体涉及一种酶标记抗体的制备方法。

背景技术

发展高效检测疾病生物标记物的诊断技术已经成为生物医学研究和临床护理的重要组成部分，并对现代分析系统有着重要的意义。在过去的几十年里，研究者们已经积极探索了各种各样的基于信号传感原理的技术，比较显著的例子包含荧光、化学发光、比色、电化学、拉曼和等离子方法。而用简单和可支付得起的技术检测疾病生物标记物对提高人们的生活水平来说是必不可少的，尤其是资源短缺的地区和国家。基于酶的比色测定(酶和生物受体提前结合，对显色底物进行转移催化产生颜色信号)，例如酶联免疫吸附测定、免疫组织学、免疫印迹，由于其简单性和成本效益而持续吸引了越来越多的关注，它们不仅可以经简单训练的人员用低成本的设备(分光光度计、普通光学显微镜等)进行试验操作，甚至在肉眼下可观测，这使得这项技术非常适合在资源有限的环境下进行诊断，进而使得基于酶的比色测定被人们广泛认可。

然而，在临床诊断中，传统酶免疫测定的缺点主要表现在酶标抗体的操作过程繁琐，检测的灵敏度低，从而使它们的应用大大受到限制。在传统基于酶的比色测定中，酶标记抗体是能否实现对特定抗原分析物进行定量检测的关键，检测颜色的信号由酶(一般为HRP)结合抗体并特异性地将底物转化为有色分子。常用的酶(HRP)与抗体交联方法为戊二醛法和过碘酸钠法。对于戊二醛法，其重复性好，但是酶的利用率低，一般只有2％～4％酶与蛋白质结合。而过碘酸钠法的酶利用率高，但是酶标记物时的偶联过程使酶活性和抗体活性的损失较高，且操作中对于过碘酸钠的浓度和工作pH等都需十分注意，针对不同批次的酶之间存在糖基化程度有差别的特点，使用过碘酸钠法时需对不同批次的方法有所调整。另一方面，由于重组抗体和许多单克隆抗体不含糖基，若准备用该法连接这类抗体时，需事先确定抗体上是否有合适的修饰位点。这两种方法不仅都涉及使用高浓度的酶和抗体，也需要较为繁琐的分离与纯化步骤，如凝胶过滤、长时间透析或亲和层析柱纯化等。除此之外，检测的灵敏度主要取决于酶的性质。提高灵敏度的一般策略是尽可能多的组装酶在载体(例如：亲和素、聚合物和纳米材料)上以实现颜色信号放大。例如，等人将HRP结合到作为载体的金纳米颗粒上，并将这种结合物作为标签，应用于ELISA测定乳腺癌生物标记物，使检测的灵敏度提高了10倍左右。Qian等人用作为载体的金纳米颗粒和氧化石墨烯结合HRP，进一步提高了HRP的运载量，使检测的灵敏度提高了64倍。这些证明了检测的灵敏度取决于酶的催化效率和载体上运载酶的数量。因此，减少酶活性的损失，简化实验操作步骤和找到能尽可能多的负载酶的材料而备受关注。