[发明专利]一种基于IVF与CRISPR/Cas9基因编辑技术的基因改造动物模型制备方法

权利要求书

1.一种制备基因改造动物模型的方法，其特征在于，所述方法联合IVF与CRISPR/Cas9基因编辑技术来制备基因改造动物模型，包括如下步骤：

(1)构建表达针对靶基因的sgRNA的质粒；

(2)构建打靶载体；

(3)将步骤(1)所述质粒体外转录获得的sgRNA与步骤(2)的载体以及Cas9mRNA或Cas9蛋白注射至受精卵细胞质或细胞核中，移植入受体母体动物生产基因改造动物模型；

其中所述受精卵是采用体外受精的方式获取的受精卵。

2.如权利要求1所述的方法，其中受精卵通过以下步骤获得：

(a)采集精子；

(b)采集卵子；

(c)精卵混合；

(d)收集胚胎。

3.如权利要求2所述的方法，受精卵的具体制备步骤如下：

1)采集精子

脱颈椎法处死雄鼠后，打开腹腔迅速分离出两侧的附睾尾和输精管，将附睾尾放于滤纸上尽可能去除脂肪和血管，用一次性注射器在附睾尾上开口轻轻扎数下，挤出精液用显微镊轻轻捏起，让精液进入精子获能皿微滴中，将含有雄鼠精液的的精子获能皿放置于培养箱中获能1h；

2)采集卵子

将注射过HCG后的雌鼠处死，从背部脊椎两侧的白色脂肪垫上方皮肤开口，取出两侧的输卵管，将输卵管放于盛有DPBS的皿盖内清洗血液与毛发，再移到滤纸上尽量去除周围水分，最后将输卵管放入受精皿的矿物油中，用一侧显微镊将输卵管的膨大部附近固定，同时用另一个显微镊撕破膨大部，并将卵团撕出放置在受精滴中；

3)精卵混合

从培养箱中取出获能结束的精子皿，从精子滴边缘吸取精子，加到卵子滴中，根据卵团大小，每滴加5-8uL精子，把培养皿置于培养箱中培养；

4)收集胚胎

先将所有的细胞从受精皿中吸出，使用HTF做3个微滴，清洗3遍，然后在最后一个微滴中挑选形态良好的含有2个原核的一细胞。

4.如权利要求1-2任一项所述的方法，其中步骤(2)中使用单链DNA打靶，具体过程如下：

1)dsDNA载体制备

设计并构建包含敲入位点同源臂、目的插入片段的打靶载体，将上述片段与PMD18T通用载体连接，获得dsDNA载体；

2)dsDNA转录

取dsDNA载体进行酶切，获得线性化片段，使用酚/氯仿纯化体系纯化，后获得加帽的转录产物，再与加尾反应液置于37℃温育30–45min，获得加尾产物，最后对转录成功的RNA纯化；

3)RNA反转获得单链DNA

将上步转录的RNA反转录成单链DNA；采用单链DNA打靶。

5.如权利要求1-2任一项所述的方法，其中步骤(2)中使用双链载体打靶，具体过程如下：设计并构建包含敲入位点同源臂、目的插入片段的打靶载体，将上述片段与PMD18T通用载体连接，获得dsDNA载体，使用该dsDNA载体作为打靶载体。

6.如权利要求1-2任一项所述的方法，其还包括后续的鉴定阳性的基因改造动物的步骤。