[发明专利]一种基于IVF与CRISPR/Cas9基因编辑技术的基因改造动物模型制备方法

说明书

本发明为一种基于IVF与CRISPR/Cas9基因编辑技术的基因改造动物模型制备方法，提供了一种制备基因改造动物模型的方法，该方法联合IVF与CRISPR/Cas9基因编辑技术来制备基因改造动物模型。该方式大大减少雄性动物的存放，节约空间的使用。也可确保大多数卵子受精时间保持一致，保证受精卵发育的同步性，提高可用受精卵数量，减少雌性动物的使用，大大降低了成本。

技术领域

本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及基于IVF与CRISPR/Cas9基因编辑技术的基因改造动物模型制备方法。

背景技术

基因改造动物就是对基因组进行修饰的动物，包括基因的插入、删除、突变或替换。它是按照预期的设计，通过细胞融合、细胞重组、遗传物质转移、染色体工程和基因工程技术进行修饰，使其在生物体内稳定遗传。基因改造动物对于人类疾病的研究，基因功能的发现以及新型药物的开发有重要推动作用。

基因改造动物的方法很多，如：原核显微注射法、精子载体、胚胎干细胞介导法等。原核显微注射法可直接将重组的DNA注入受精卵原核中，能直接获得所需的转基因动物，且产生转基因动物的方式可稳定遗传。2013年CRISPR技术问世后，大幅度提高基因编辑效率。CRISPR技术与显微注射法的叠加使用大大提高基因改造动物制备效率，缩短基因改造动物获得时间。

但DNA显微注射前需要得到大量的注射使用受精卵，现有方法中受精卵是从雌性动物体内直接获取。首先将雌性动物注射促排卵激素，然后将超排的雌性动物与雄性动物交配，从交配后的雌性动物体内收集受精卵。活体交配方式产生的受精卵，因不同动物卵子受精时间不一致，所获得的受精卵发育一致性较差。DNA注射的最好时期在雌雄原核融合之前，融合时间一般在几小时之内，因此胚胎的注射时间需要严密的摸索和尝试，除此之外对于受精卵发育的一致性要求较高。为保证受精卵发育的同步性及单次试验注射所需量，该方式需要同时准备大量的雄性动物与雌性动物，同时需要饲养较多适配雄性动物，以便用于配繁。大量动物的使用需要使用较大的空间来进行动物的饲养和存放。从经济角度和动物福利角度考虑，该方法存在实验动物的浪费与实验动物使用的不合理。

为解决如上问题，我们采用体外受精的方式来获取受精卵，该方式大大减少雄性动物的存放，节约空间的使用。同时体外受精的方式也可确保大多数卵子受精时间保持一致，保证受精卵发育的同步性，提高可用受精卵数量，减少雌性动物的使用。

发明内容

本发明提供了一种制备基因改造动物模型的方法，其特征在于，所述方法联合IVF与CRISPR/Cas9基因编辑技术来制备基因改造动物模型，包括如下步骤：

(1)构建表达针对靶基因的sgRNA的质粒；

(2)构建打靶载体；

(3)将步骤(1)所述质粒体外转录获得的sgRNA与步骤(2)的载体以及Cas9mRNA或Cas9蛋白注射至受精卵细胞质或细胞核中，移植入受体母体动物生产基因改造动物模型；

其中所述受精卵是采用体外受精的方式获取的受精卵。

优选地，其中受精卵通过以下步骤获得：

(a)采集精子；

(b)采集卵子；

(c)精卵混合；

(d)收集胚胎。

优选地，受精卵的具体制备步骤如下：

1)采集精子

脱颈椎法处死雄鼠后，打开腹腔迅速分离出两侧的附睾尾和输精管，将附睾尾放于滤纸上尽可能去除脂肪和血管，用一次性注射器在附睾尾上开口轻轻扎数下，挤出精液用显微镊轻轻捏起，让精液进入精子获能皿微滴中，将含有雄鼠精液的的精子获能皿放置于培养箱中获能1h；

2)采集卵子