[发明专利]一种快速制备单分子光学图谱标记文库的方法和试剂盒

说明书

本发明涉及一种快速制备单分子光学图谱标记文库的方法，包括以下步骤：(1)提取长片段基因组DNA；(2)标记提取的基因组DNA；(3)纯化标记的基因组DNA，和(4)将基因组DNA的骨架染色，获得单分子光学图谱标记文库。本发明还涉及用于制备单分子光学图谱标记文库的试剂盒。

技术领域

本发明涉及一种快速制备单分子光学图谱标记文库的方法，以及适用于此方法的试剂盒。

背景技术

人类许多疾病是由于染色体结构变异引起的。现在常用的染色体结构分析的方法有核型分析、芯片杂交等。然而，这些技术均存在一定局限性，比如分辨率低、成本高、不能覆盖全基因组等。长片段单分子光学图谱技术的发展弥补了上述技术的局限。BioNano公司推出的Irys和Saphyr系统利用限制性切刻酶或甲基化转移酶对DNA进行识别并标记荧光¹，再利用纳米通道把DNA单分子线性化展开，并进行超长单分子高分辨率荧光成像，即可生成一幅特异酶位点分布图。单分子光学图谱技术可以辅助基因组组装、检测染色体结构变异和基因遗传病的检测²。然而，现阶段的单分子光学图谱标记文库的制备存在耗时长、制备过程繁琐等缺点，并不适用于临床检测。

此外，光学图谱技术的优势是可以在单分子水平上标记DNA，因此基因组DNA片段的长度是决定光学图谱标记效果的重要因素之一。一般要求DNA片段的平均长度大于200Kb，最长的DNA片段达到Mb级别。目前一般采用基于低熔点琼脂糖凝胶包埋的固相方法获得用于制备光学图谱标记文库的长片段基因组DNA^3-6。该方法可提取长达Mb级别的高纯度基因组DNA，但是包括将细胞包埋成琼脂糖胶块、蛋白酶K消化处理、胶块熔解、胶块酶解和基因组DNA透析等步骤，操作过程非常繁琐，耗时超过24小时。并且，这种方法提取的长片段基因组DNA产率往往不稳定，非常黏稠，均一性差导致难以测度浓度，从而影响后续光学图谱标记的质量。这种固相长片段基因组DNA提取加上BioNano公司的直接标记染色(Direct Labeling and Staining，DLS)，使得制备光学图谱标记文库总共需要长达3.5天的时间。这些因素都不利于光学图谱技术的大规模推广使用。

为解决以上问题，本发明提供了一种基于液相系统的快速制备光学图谱标记文库的方法，仅包含提取长片段基因组DNA、标记基因组DNA、纯化标记的基因组DNA和将基因组DNA染色四个步骤。该方法简化了光学图谱标记的流程，将时间由原来的3.5天缩短为8小时，并且最终获得的标记文库质量较高，重复性强，有利于单分子光学图谱技术在临床检测上的应用。

发明内容

本发明的目的在于解决现阶段单分子光学图谱文库制备耗时长、过程繁琐等问题。通过液相提取长片段基因组DNA并简化单分子光学图谱标记流程，本发明能够实现快速单分子光学图谱标记文库的快速制备。

因此，第一个方面，本发明提供一种快速制备单分子光学图谱标记文库的方法，包括以下步骤：

(1)提取长片段基因组DNA；

(2)标记提取的基因组DNA；

(3)纯化标记的基因组DNA，和

(4)将基因组DNA的骨架染色，获得单分子光学图谱标记文库。

在一个实施方案中，提取长片段基因组DNA的步骤包括细胞裂解、基因组DNA沉淀、基因组DNA清洗和基因组DNA溶解。在一个优选的实施方案中，提取长片段基因组DNA的步骤包括以下子步骤：

a)向样品中加入裂解液和蛋白酶K，使细胞裂解并释放基因组DNA；

b)向步骤a)的反应体系中加入沉淀剂，获得基因组DNA的沉淀；

c)用清洗液洗涤所得的基因组DNA的沉淀；

d)用溶解液溶解基因组DNA。