[发明专利]一种利用中动脉观察血管干细胞附壁的方法

说明书

本发明提供一种利用中动脉观察血管干细胞附壁的方法，合理优化灌流操作，并采用新型灌流液和灌流助剂，所述灌流液为含有0.1～0.2mmol/L麦冬多糖的任‑洛液，所述灌流助液为含有5～10mmol/L的氯化钾、5～8mmol/L的氯化镁、0.1～0.2mmol/L麦冬多糖和0.5～1.5mmol/L柠檬酸钠的生理盐水。本发明易于实施、操作简便、结果明确，且有效缩短操作时间，易于推广应用。

技术领域

本发明涉及细胞观察技术领域，具体涉及一种利用中动脉观察血管干细胞附壁的方法。

背景技术

目前，观察血管干细胞、内皮前体细胞的方法主要为体内观察法：局部植入或静脉输入荧光标记(如GFP、CM-Dil等标记)的细胞，于不同时间段，取待测靶血管进行观察；或植入/输入其他方式标记(如BrdU)的细胞，于不同时间段，取血管标本，用组织化学、荧光免疫组织化学等方法观察、评价。这两种方法共同缺点有：①不能实时观察，观察时间点的选择有盲目性和随意性，观察点的取舍有随机性，从而影响评价的准确性；②了解细胞归巢、黏附动态变化、影响因素难度大，需投入较大的时间和成本。用超顺磁性氧化铁(造影剂)标记细胞磁共振成像可在体原位实时观察细胞附壁，但超顺磁性氧化铁有细胞毒性，如何解读观察结果仍存在争议。

此外，还出现了体外观察方法，如专利ZL201310156400.7公开了“一种观察血管干细胞附壁的方法”，包括以下步骤：1)取待观察的血管干细胞，用荧光染料进行标记后，备用；2)在恒温恒压条件下，对暴露出中动脉的新鲜离体耳灌流5～10min，灌流液自耳中动脉流入，由耳静脉流出；其中，所述暴露出的中动脉为完整的中动脉或损伤的中动脉；3)将步骤1)得到的经荧光染料标记的血管干细胞加入灌流液中，在恒温恒压条件下，避光循环灌流1～4h后，经洗脱、固定后，置于倒置荧光显微镜下观察。该发明易于实施、操作简便、结果明确，证明了用离体耳中动脉观察荧光标记的血管干细胞附壁是可行的。但是，该专利中需要避光循环灌流的时间为1～4h，耗时较长，该方法推广应用尚存在一定的局限性。

发明内容

鉴以此，本发明的目的是提供一种利用中动脉观察血管干细胞附壁的方法，主要对灌流步骤进行改进，有效解决现有技术中灌流时间过长的问题。

本发明的技术方案是：

一种利用中动脉观察血管干细胞附壁的方法，包括以下步骤：

1)在恒温恒压条件下，对暴露出中动脉的新鲜离体耳灌流3～5min，灌流液自耳中动脉流入，由耳静脉流出；

2)将经荧光染料标记的血管干细胞加入灌流液中，在恒温恒压条件下，避光循环灌流3～5min后，改用灌流助液循环灌流5～8min，再继续用含有经荧光染料标记的血管干细胞的罐流液循环灌流3～5min，经洗脱、固定后，置于倒置荧光显微镜下观察；

3)结果判断：损伤的中动脉的受损部位观察到荧光，完整的中动脉未观察到荧光；

其中，所述灌流液为含有0.1～0.2mmol/L麦冬多糖的任-洛液，所述灌流助液为含有5～10mmol/L的氯化钾、5～8mmol/L的氯化镁、0.1～0.2mmol/L麦冬多糖和0.5～1.5mmol/L柠檬酸钠的生理盐水。

优选的，所述的血管干细胞为内皮前体细胞，内皮前体细胞粘附于损伤的中动脉的受损部位。

优选的，所述灌流液为含有0.2mmol/L麦冬多糖的任-洛液。

优选的，所述灌流助液为含有5mmol/L的氯化钾、5mmol/L的氯化镁、0.1mmol/L麦冬多糖和1.5mmol/L柠檬酸钠的生理盐水。

优选的，灌流速度为2.0mL/min。

优选的，加入灌流液中的经荧光染料标记的血管干细胞的量为1×10³个细胞/mL灌流液。