[发明专利]一种肾阳虚外感小鼠模型肺组织qPCR内参基因组合及其筛选方法

权利要求书

1.一种肾阳虚外感小鼠模型肺组织qPCR内参基因组合的筛选方法，其特征在于，首先分别设计15个内参基因Actb，β2m，Gapdh，Gusb，Tuba，Grcc10，Eif4h，Rnf187，Nedd8，Ywhea，18S rRNA，RPL13，Ubc，RPL32，Ppia的特异性引物，上下游引物序列依次如SEQ ID NO.1-30所示，然后以肾阳虚外感小鼠模型，cDNA为模板，分别利用所述特异性引物对15个内参基因进行RT-qPCR分析，确立所述肾阳虚外感小鼠模型肺组织qPCR内参基因组合；

所述RT-qPCR分析采用双基因两两组合的方法，并对两两组合的双基因在正常组和模型组之间的基因表达差异进行T检验，选择组合的P值大于0.05以上，又进行了这些组合的正常组与模型组差值的绝对值比较，筛选差值的绝对值最小的组合作为双参考基因的最优化组合；

所述最优化组合为Grcc10和Ppia；

所述肾阳虚外感小鼠模型为肾阳虚外感H1N1小鼠。

2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）复制肾阳虚模型；

（2）建立肾阳虚外感模型；

（3）RT- qPCR 检测肺组织中H1N1的mRNA的表达；

（4）提取动物组织总RNA；

（5）反转录合成cDNA；

（6）设计扩增引物进行RT-qPCR扩增；分别设计15个内参基因Actb，β2m，Gapdh，Gusb，Tuba，Grcc10，Eif4h，Rnf187，Nedd8，Ywhea，18S rRNA，RPL13，Ubc，RPL32，Ppia，所述内参基因的特异性引物序列依次如SEQ ID NO.1-30所示；

（7）内参基因的RT-qPCR分析；采用双基因两两组合的方法，并对两两组合的双基因在正常组和模型组之间的基因表达差异进行T检验，选择组合的P值大于0.05以上，又进行了这些组合的正常组与模型组差值的绝对值比较，筛选差值的绝对值最小的组合可作为双参考基因的最优化组合，分析得Grcc10+Ppia组合基因为肾阳虚外感小鼠模型的稳定内参基因。

3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤（1）所述的复制肾阳虚模型的方法为以4mL/kg腹腔注射2mg/mL苯甲酸雌二醇稀释液，每日1次，连续7d，复制肾阳虚模型。

4.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤（2）所述的建立肾阳虚外感模型的方法为给予麻醉后的肾阳虚小鼠滴鼻接种流感病毒H1N1鸡胚尿囊液20 μL/只，正常组滴鼻等体积的生理盐水，接种病毒的小鼠隔离喂养，自由进食进水6 d，解剖处死；其中鸡胚尿囊液的半数组织培养感染剂量为TCID50 2.34×10⁸。

5.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤（6）所述的RT-qPCR的扩增程序为：95℃ 15min下进行1个循环，95℃ 10s和60℃ 32s进行40个循环。

6.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤（7）所述的内参基因的RT-qPCR分析的具体步骤为：1）15个内参基因特异性引物PCR扩增；2）15个内参基因的表达水平确定；3）BestKeeper、geNorm和NormFinder软件对肾阳虚外感模型15个内参基因稳定性表达分析；4）15个内参基因两两组合T检验；5）内参基因稳定性验证；6）得Grcc10+Ppia组合基因为肾阳虚外感小鼠模型的稳定内参基因。

7.根据权利要求6所述的筛选方法，其特征在于，用于内参基因稳定性验证所选的目标基因为TLR3、TLR4、TLE7、RIG-1；目标基因的引物序列依次如SEQ ID NO.31-38所示。