[发明专利]一种肾阳虚外感小鼠模型肺组织qPCR内参基因组合及其筛选方法

说明书

本发明提供了一种肾阳虚外感小鼠模型肺组织qPCR内参基因组合的筛选方法，设计15个内参基因Actb，β2m，Gapdh，Gusb，Tuba，Grcc10，Eif4h，Rnf187，Nedd8，Ywhea，18S rRNA，RPL13，Ubc，RPL32，Ppia的特异性引物，上下游引物序列依次如SEQ ID NO.1‑30所示，然后以肾阳虚外感小鼠模型cDNA为模板，分别利用所述特异性引物对15个内参基因进行RT‑qPCR分析，结合组间t检验及组间平均值的绝对值比较，能方便快捷确立所述肾阳虚外感小鼠模型肺组织qPCR内参基因组合为Grcc10和Ppia。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术，特别涉及一种基于qPCR技术的内参基因组合及其筛选方法。

背景技术

实时荧光定量PCR技术(quantitative real-time PCR, qPCR)是一种实时监测PCR扩增产物并进行解析的定量方法，具有敏感性高、重复性好、检测速度快、自动化程度高等诸多优点，目前已被国内外学者广泛应用。该技术一般需要用表达稳定的内参基因对靶基因的表达情况进行校正和标准化。理想的内参基因应在各种试验条件下，各种类型的组织和细胞中均恒定表达，而且其表达量是近似的，无显著性差异。然而，不同类型的组织，不同的发育阶段和不同处理条件下内参基因转录水平均可能发生变化，因此，选择合适的内参基因以减少检测样本间的差异，决定了利用荧光定量PCR分析基因表达水平结果的可靠性。

以往的研究多以表达量众多的内参基因如核糖体RNA 18S rRNA或28S rRNA、3-磷酸甘油脱氢酶以及肌动蛋白等作为内参。然而，大量的研究表明，这些常用的内参基因在不同实验条件下的表达也有变化。不稳定内参基因的使用会导致qPCR的结果出现严重偏差。很多研究表明，一个广泛通用的内参基因是不存在的，研究者在每一个实验或物种中都需要寻找合适的稳定表达的基因作为内参。Bestkeeper、geNorm和NormFinder等广泛用作内参基因筛选软件，可帮助研究人员在不同的研究中选择稳定的内参基因，但这些软件筛选到的单内参或双内参基因都不适合用于肾阳虚外感病证肺组织的内参基因。近年来，文献多见于玉兰^[8]、泽泻^[9]、川续断^[10]等药用植物的RT-qPCR内参基因筛选的报道越来越多，但目前尚无关于肾阳虚外感小鼠模型肺组织RT-qPCR内参基因筛选的报道。

发明内容

本发明的发明目的为引入了统计分析的组间t检验方法，能高效、准确地筛选到合适的双内参基因组合，可用于后续开展对肾阳虚外感病证肺组织目的基因表达的研究。

为实现上述发明目的，采用以下技术方案：

一种肾阳虚外感小鼠模型肺组织qPCR内参基因组合，其特征在于，所述内参基因组合为Grcc10和Ppia。

上述的肾阳虚外感小鼠模型肺组织qPCR内参基因组合的筛选方法，首先分别设计15个内参基因Actb，β2m，Gapdh，Gusb，Tuba，Grcc10，Eif4h，Rnf187，Nedd8，Ywhea，18SrRNA，RPL13，Ubc，RPL32，Ppia的特异性引物，上下游引物序列依次如SEQ ID NO.1-30所示，然后以肾阳虚外感小鼠模型,cDNA为模板，分别利用所述特异性引物对15个内参基因进行RT-qPCR分析，确立所述肾阳虚外感小鼠模型肺组织qPCR内参基因组合。

优选地，筛选方法包括以下步骤：

（1）复制肾阳虚模型；

（2）建立肾阳虚外感模型；

（3）RT- PCR 检测肺组织中H1N1的mRNA的表达；

（4）提取动物组织总RNA；

（5）反转录合成cDNA；