[发明专利]一种利用毛细管电泳荧光SSR指纹图谱鉴别白蜡新品种金箭的方法

权利要求书

1.一种利用毛细管电泳荧光SSR指纹图谱鉴别白蜡品种金箭的方法，步骤是：

（1）由白蜡幼嫩叶片提取白蜡基因组DNA；

（2）以提取的DNA 为模板，利用筛选出的SSR引物对进行PCR扩增；

（3）将PCR扩增产物进行毛细管电泳；

（4）根据电泳结果中每对SSR引物的峰值，组合形成白蜡品种金箭的SSR指纹图谱，实现对白蜡品种金箭的鉴别；

其特征是：

步骤(1)中DNA的提取采用CTAB法，提取缓冲液中加入2%β-巯基乙醇和2%PVP；紫外分光光度法测定DNA的浓度和纯度，稀释至30 ng·μl^-1，-20℃保存，备用；

步骤（2）筛选出的SSR引物对为6对，分别是F186和R186，F187和R187，F202和R202，F203和R203，F208和R208，F213和R213，其中在每对引物5′端加有选自FAM、TAMRA、HEX和ROX中的任意一种荧光标记，正向引物为与携带荧光标记的TP-M13引物组成；所述F186和R186引物对中F186的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，R186的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述F187和R187引物对中F187的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，R187的核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示，所述F202和R202引物对中F202的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，R202的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，所述F203和R203引物对中F203的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，R203的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，所述F208和R208引物对中F208的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，R208的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示，所述F213和R213引物对中F213的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，R213的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；

PCR反应体系为10 μL：10ng.μL^-1的DNA 模板1μL、2X Taq plus PCR Master Mix 5μL、10 μmol·L^-1的正反向引物各0.1 μL以及 ddH₂O共10μL；

PCR扩增程序采用Touchdown 模式： 95℃预变性5 min；95℃变性30 s，56℃退火30 s；每个循环降低0.5℃；72℃延伸30 s ，15个循环；95℃变性30 s ，54℃退火30 s ，72℃延伸30 s ，20个循环；72℃延伸10 min，4℃保存；

步骤（3）所述将PCR扩增产物进行毛细管电泳的方法是：取PCR产物0.3μL、GS-500LIZ分子量内标0.5μL和去离子甲酰胺9.5μL混合加入PCR板，95℃变性5min，4℃冷却后离心，1×Buffer缓冲液上机检测；采用3730xl DNA 测序仪进行毛细管电泳：预电泳15 kV下3min；1.6kV下进样15 s；电泳15 kV下20 min；

步骤(4)所述的鉴别方法是：采用GenemarkerZ.2.0软件进行数据整理和图像分析，根据每对SSR引物的峰值，组合形成白蜡品种金箭的SSR指纹图谱；其中，F186和R186引物对的峰值为93/99，F187和R187引物对的峰值为134/140，F202和R202引物对的峰值为109/112，F203和R203引物对的峰值为157，F208和R208引物对的峰值为139/145，F213和R213引物对的峰值为81/90/96。