[发明专利]一种灭活饲养细胞联合细胞因子刺激NK细胞扩增的方法

权利要求书

1.一种灭活饲养细胞联合细胞因子刺激NK细胞扩增的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：

1）配制次氯酸液

用DPBS溶液将次氯酸钠溶液配制成浓度为60mM的次氯酸储存液；

2）然后将次氯酸储存液加入到重组K562细胞中，吹打混匀，

3） 将细胞悬浮液放入37℃，5%CO₂的二氧化碳培养箱中培养1小时，期间每30min吹打混匀一次，诱导饲养细胞氧化死亡；

4） 1小时以后，100g，5min离心收集细胞，用DPBS洗涤，培养基重悬制成灭活重组K562细胞；

5）将分离的人外周血单核细胞用培养基重悬，按1:1的比例加入灭活重组K562细胞，10%的自体血浆，添加细胞因子组合IL-2、 CD16 mAb 和CD3 mAb；PBMC的接种浓度范围为1x10⁶ cells/ml-1.5x10⁶ cells/ml，放37℃，5%CO₂培养箱中培养至第三天，补加添加了IL-2的新鲜培养基；

所述的IL-2添加的终浓度为800U/ml，CD16 mAb 添加终浓度为600ng/ml，CD3 mAb 添加的终浓度为20ng/ml；

6）培养期间每隔2或3天补加新添加了IL-2的新鲜培养基，维持细胞浓度在5x10⁵ cells/ml以上，在培养的第14天，离心收集全部培养所得细胞；

所述的2）中次氯酸的使用浓度为60µM/ml；

所述的2）中重组细胞浓度为1 x 10⁶ cells/ml。