[发明专利]一种灭活饲养细胞联合细胞因子刺激NK细胞扩增的方法

说明书

本发明的目的是提供一种新型灭活重组K562细胞联合细胞因子组合刺激NK细胞扩增的方法。本发明制备得到的NK细胞，具有很高的纯度和杀伤活性，经检测培养至14天时，NK细胞纯度达90％以上；当效靶比为10:1时，NK细胞对K562细胞的杀伤活性为80％以上。本发明制备的NK细胞增殖速度快，培养至14‑17天细胞扩增倍数达500以上，本发明制备的NK细胞有很好的靶向杀伤肿瘤细胞的效果。

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种灭活饲养细胞联合细胞因子刺激NK细胞(Natural killer cells)扩增的方法。

背景技术

目前，癌症已经成为全球第一死亡原因。常规治疗癌症的手段有：手术、放疗和化疗三种方式。免疫细胞治疗是继手术、化疗和放疗之后的第四大治疗肿瘤的新方式，其能系统杀灭肿瘤细胞，有效抑制肿瘤细胞的转移，副反应小，临床效果好。

免疫细胞治疗应用于临床的有DC细胞、CIK细胞、DC-CIK细胞和NK细胞。NK细胞是第三类淋巴细胞，不同于T/B淋巴细胞，无需抗原刺激即可发挥细胞毒效应，能自发溶解多种肿瘤细胞和被病毒感染的细胞，还可以分泌多种细胞因子和趋化因子参与免疫调节。NK细胞的免疫治疗在抗病毒，抗肿瘤的治疗中有着广泛的应用前景。近些年，临床上将NK细胞用于免疫治疗的例子在不断增多。

目前，体外扩增NK系统主要通过以下三种方法：一是采用免疫磁珠的方法从PBMC中将NK细胞分离出来再培养；二是单纯的细胞因子组合刺激PBMC中NK细胞的扩增。三是采用饲养细胞(基因修饰)的方法培养PBMC中的NK细胞。采用饲养细胞培养NK细胞可以获得大量高纯度NK细胞，但容易引来外来细胞系污染；所以饲养细胞的灭活方法是至关重要。常规灭活饲养细胞的方法有两种，一是γ射线或Co60放射灭活，二是细胞反复冻融的方法。射线能彻底灭活，但是对仪器设备要求高，试验成本高；反复冻融的方法对试验仪器要求低，但灭活不彻底，需要反复多次操作，很难保持细胞形态额完整性，从而影响NK刺激效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型灭活重组K562细胞联合细胞因子组合刺激NK细胞扩增的方法。该灭活处理方法对仪器设备要求低，成本低，操作过程简单可以被广泛应用。且本发明采用饲养细胞和细胞因子组合联合刺激的方法刺激PBMC中NK细胞的扩增，可以获得大量高效杀伤活性的NK细胞，培养过程简单，完全可以满足临床需要。

本发明所提供的灭活饲养细胞联合细胞因子刺激NK细胞扩增的方法，包括以下步骤：

1)配制次氯酸液

用DPBS(TBD货号：PB2005Y)溶液将次氯酸钠(Sigma货号：

239305-25ml)溶液配制成浓度为60mM的次氯酸储存液；

2)然后将次氯酸储存液加入到重组K562细胞中，吹打混匀，次氯酸的使用浓度为60uM/ml，重组细胞浓度为1x 10⁶cells/ml；

3)将细胞悬浮液放入37℃，5％CO₂的二氧化碳培养箱中培养1小时，期间每30min吹打混匀一次，诱导饲养细胞氧化死亡；

4)1小时以后，100g，5min离心收集细胞，用DPBS洗涤，培养基(TAKARA货号：GT-T551-H3)重悬制成灭活重组K562细胞；

5)将分离的人外周血单核细胞(PBMC)用培养基重悬，按1:1的比例加入灭活重组K562细胞，10％的自体血浆，添加细胞因子组合IL-2至终浓度为

800U/ml，CD16mAb终浓度为600ng/ml，CD3mAb终浓度为20ng/ml；PBMC