[发明专利]可溶性水凝胶微球及其制备方法与在单细胞检测中的应用

权利要求书

1.一种基于液滴微流控技术的单细胞检测方法，其特征在于包括：

使丙烯酰胺、N,N-双(丙烯酰)酰胺、乙酸和2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮混合均匀，形成混合母液，所述丙烯酰胺与N,N-双(丙烯酰)酰胺的质量比为15：1~29：1，所述2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮与混合母液的体积比为10~50µL：1mL；

使所述混合母液与氢氧化钠混合均匀，得到预聚物溶液；

采用单乳液装置，以所述预聚物溶液为内相、油相物质为外相，所述预聚物溶液的流速为200~400µL/h，所述油相物质的流速为400~600µL/h，制备得到微液滴，之后于30℃~65℃在线聚合10~14小时，获得可溶性水凝胶微球；

将所述可溶性水凝胶微球标记上条形码，得到带有条形码标记的可溶性水凝胶微球；

采用液滴微流控装置，将单细胞悬液、带有条形码标记的可溶性水凝胶微球、逆转录酶裂解液和油相物质注入液滴微反应器中，并形成油包水的液滴，其中，所述液滴中包含至少一个单细胞和至少一个带有条形码标记的可溶性水凝胶微球，且所述可溶性水凝胶微球上的条形码能够特异性捕获单细胞裂解后释放出的遗传物质；

打碎所述液滴，并在室温下，采用二巯基苏糖醇溶液、α－巯基乙醇和β－巯基乙醇的混合液对所述可溶性水凝胶微球进行溶解，在逆转录酶的作用下，特异性的催化逆转录反应，进行cDNA扩增；

通过特定程序识别条形码，区分单细胞。

2.根据权利要求1所述的单细胞检测方法，其特征在于：所述可溶性水凝胶微球的直径为20~120µm。

3.根据权利要求1所述的单细胞检测方法，其特征在于：所述油相物质选自硅油和/或全氟三丁胺。

4.根据权利要求1所述的单细胞检测方法，其特征在于还包括：对所获可溶性水凝胶微球进行收集，并进行清洗以除去多余的油相物质，之后用乙醇水溶液梯度置换，使所述可溶性水凝胶微球收集于水中。

5.根据权利要求1所述的单细胞检测方法，其特征在于包括：将二硫基苏糖醇用乙酸-乙酸钠缓冲液溶解，得到二硫基苏糖醇溶液。

6.根据权利要求1所述的单细胞检测方法，其特征在于：打碎所述液滴的方法选自物理方法或化学方法。

7.根据权利要求6所述的单细胞检测方法，其特征在于：所述物理方法选自改变温度法或通电法。

8.根据权利要求1所述的单细胞检测方法，其特征在于具体包括：将单细胞悬液、带有条形码标记的可溶性水凝胶微球、逆转录酶裂解液和油相物质借助注射泵或真空泵注入液滴微反应器的微流控芯片通道内，并形成油包水的液滴。

9.根据权利要求1所述的单细胞检测方法，其特征在于：所述液滴中包含单个的单细胞和单个的带有条形码标记的可溶性水凝胶微球。

10.根据权利要求1所述的单细胞检测方法，其特征在于：所述可溶性水凝胶微球为聚丙烯酰胺水凝胶微球。

11.根据权利要求1所述的单细胞检测方法，其特征在于：所述单细胞悬液选自细菌悬液、真菌悬液和动物细胞悬液中的任意一种或两种以上的组合。

12.根据权利要求1所述的单细胞检测方法，其特征在于：所述油相物质选自全氟三丁胺全氟油相组分和表面活性剂。

13.根据权利要求12所述的单细胞检测方法，其特征在于：所述表面活性剂选自司盘80和/或吐温20。

14.根据权利要求1所述的单细胞检测方法，其特征在于：所述单细胞裂解后释放出的遗传物质为DNA和/或RNA物质。