[发明专利]可溶性水凝胶微球及其制备方法与在单细胞检测中的应用

说明书

本发明公开了一种可溶性水凝胶微球及其制备方法与在单细胞检测中的应用。所述制备方法包括：使丙烯酰胺、N,N‑双(丙稀酰)酰胺、乙酸和2‑羟基‑2‑甲基‑1‑苯基‑1‑丙酮混匀，加入氢氧化钠得到预聚物溶液；采用单乳液装置，以预聚物溶液为内相、油相物质为外相，得到微液滴，在线聚合获得所述微球。所述单细胞检测方法包括：在可溶性水凝胶微球上标记条形码，将其与单细胞悬液、逆转录酶裂解液注入液滴微反应器中形成油包水的液滴，打碎液滴并溶解所述水凝胶微球，进行特异性的催化逆转录反应，以及进行cDNA扩增；通过识别条形码区分单细胞。本发明的单细胞检测方法既能有效提高逆转录酶的利用率又能解决通道堵塞。

技术领域

本发明涉及一种单细胞检测方法，特别涉及一种可溶性条形码标记水凝胶微球及其制备方法，以及利用液滴微流控芯片技术进行单细胞检测，并检测单细胞相关生命信息的方法，属于核酸检测分析及检测技术领域。

背景技术

单细胞测序技术旨在单个细胞水平对基因组或转录组进行扩增并测序，反应单个细胞的遗传信息，这是因为即使来源相同的单个细胞，由于受到生物过程和环境扰动的原因，彼此在许多方面也存在差异，这就是我们所说的细胞异质性。常规的基因组测序技术无法避免细胞异质性带来的影响，这一现象在肿瘤组织中的表现尤为重要，肿瘤组织是一种高度异质性的组织，隐藏在人体循环系统里的循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,CTC)进行全基因组或者转录组测序最有帮助，有关CTC细胞的信息对于疾病的诊断、监测和治疗都至关重要。

液滴微流控技术是在封闭的微通道网络中生成和操控纳升至皮升级液滴的科学与技术。液滴微流控系统可在短时间内生成大量的微反应器，每个液滴皆可作为独立的微反应器，体积可小至皮升或飞升，不仅大大降低了样品与试剂的消耗，而且缩短了反应时间。

目前用于单细胞检测的方法主要有Smart-seq、CEL-seq、SCRB-seq和DROP-seq四种方法，其中以微滴为基础的微流体装置将带有条码的微珠和细胞一起装入微小的液滴，建立了快速、廉价、高通量的单细胞RNA-seq方法。这种技术将细胞隔离在微小的液滴中，装上用于扩增的条码引物，由此检测数以千计的细胞。Drop-seq能够帮助生物学家进一步发现和分类人体细胞，绘制大脑等复杂组织的细胞多样性图谱，更好地了解干细胞分化，获得更多疾病的遗传学信息，因此Drop-seq技术受到越来越多的研究者的青睐，已成为单细胞测序的热点。

Drop-seq此项技术目前的实现方法一般是将单细胞悬液样品和带有条形码的微珠以及逆转录酶(RT)裂解液，通过微流体芯片，包裹在一个油滴之中。在油滴中进行逆转录之后，每一个单细胞的cDNA文库，就带上了独一无二的条形码了。最后，我们再将所有的单细胞cDNA文库混在一起测序，再通过程序识别条形码，区分单细胞。

目前实现Drop-seq的方法主要有两种。第一种方法是采用塑料珠作为承载条形码的微珠，利用微流控装置将单细胞悬液、带有条形码的塑料珠以及裂解液逆转录酶(RT)混合液包裹在一个液滴微反应器中。在裂解液的作用下，单细胞被裂解，RNA等遗传物质从裂解的细胞中释放出来，被条形码特异性捕获，形成了特异性单链。随后在逆转录酶的作用下，特异性的催化逆转录反应，进行cDNA扩增。这种方法主要存在的问题是塑料珠的可塑性差，在液滴的形成过程中导致通道的阻塞，从而降低单细胞的捕获率。

第二种方法采用水凝胶微球作为承载条形码的微珠，利用微流控装置将单细胞悬液、带有条形码的水凝胶以及裂解液逆转录酶(RT)混合液包裹在一个液滴微反应器中。在裂解液的作用下，单细胞被裂解，RNA等遗传物质从裂解的细胞中释放出来，被条形码特异性捕获，在逆转录酶的作用下，特异性的催化逆转录反应，整个反应过程均在单个液滴微反应器中进行。这种方法虽然利用了水凝胶微球的可塑性，避免了通道堵塞的现象，但是由于cDNA扩增反应过程是在单个液滴微反应器中进行的，液滴微反应器中未包裹单细胞悬液的逆转录酶未起到作用，一定程度降低了逆转录酶的利用率。