[发明专利]一种通用型CAR-T细胞及其制备方法和用途

说明书

本发明提供了一种sgRNA或PTG(Polycistronic tRNA‑gRNA)，结合CRISPR‑Cas9技术可以敲除T细胞抗原受体(TCR)，或者主要组织相容性复合体(MHCⅠ)及免疫抑制分子相关基因中的一个或多个。本发明还提供了一种表达嵌合抗原受体(CAR)，且不表达TCR的通用型CAR‑T细胞及其制备方法。本发明制备得到的通用型CAR‑T细胞适用异种受体，具有通用性，同时具有更强的杀伤力。

技术领域

本发明属于医药、生物细胞学和分子生物学领域，涉及免疫治疗领域。具体地，涉及采用sgRNA或PTG(Polycistronic tRNA-gRNA)敲除T细胞的一个或多个基因，并引入嵌合抗原受体(CAR)，以获得功能增强的通用型CAR-T细胞。

背景技术

近几年，肿瘤免疫治疗进入了快速发展阶段，CAR-T疗法作为其中一种重要的方法在血液学恶性肿瘤治疗中取得了非常令人鼓舞的结果。目前，国内越来越的企业、医院及学术机构加入到这一研究领域中，共同推进CAR-T疗法的发展，探索更为广泛的潜在应用价值。

目前，在嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)治疗领域，主要是采用自体的CAR-T细胞进行治疗，基本过程是采集患者自己的外周血，分离T细胞，并完成CAR-T细胞的制备和回输。因受限于免疫系统自身的某些限制性因素，如CAR-T异体回输时由于免疫原性等原因导致的免疫排斥、移植物抗宿主反应(GVHD)等，这将限制CAR-T细胞治疗技术广泛性和便捷性应用，同时也在一定程度上提高了该技术的成本，另外，对于婴儿患者、或者70岁以上的老年患者，或者一些经过多次放化疗而摧毁免疫系统或者使T细胞功能弱化的肿瘤患者，其自体的T细胞的质量和数量达不到要求，是不适合制备CAR-T进行肿瘤治疗的。所以，通用型CAR-T技术将是今后的一个方向，在基因编辑技术如ZFN(zinc-finger nucleases)、TALEN(transcription activator-like effector nucleases)和CRISPER-Cas9等的进步下，如果能够实现对健康供体来源的T细胞TCR及其他导致不同个体间免疫原性的基因的敲除，将会使CAR-T这一技术真正成为一种活的药物，进而能够广泛而方便的供合适的患者使用，实现CAR-T细胞治疗的产业化，并极大地降低成本。

目前，已研究出通用型的CAR-T(universal-CAR-T,uCAR-T)细胞。如Cellectis的UCART19也是一种同种异体CAR-T细胞疗法，基于Talen基因编辑TCR-α链的表达，不需要依据患者进行相应修饰，而是直接将来源于非患者(non-patient)供体的T细胞进行工程化，用于多个患者的治疗。通用型的CAR-T细胞也并非完美无缺，如存在供体隐匿性感染问题；基因的敲除并不能完全消除双相排斥作用；uCAR-T细胞库的数量、复苏和代次问题，对临床应用和治疗效果会有一定的影响；基因的“脱靶”效应可能会影响一些潜在的安全性问题。面对这些可能存在的问题，许中伟、黄晓军等人则没有采用基因编辑，而是采集患者的亲属的健康T细胞，该种方法无需细胞的冷冻复苏，无需抽患者血液，同时适度的GLV的存在也可以增强T细胞的杀伤力。

T细胞(抗原)受体(T cell receptor,TCR)为所有T细胞表面的特征性标志，以非共价键与CD3结合，形成TCR-CD3复合物。TCR的作用是识别抗原。TCR是由两条不同肽链构成的异二聚体，由α、β两条肽链组成，分别由TRAC和TRBC基因表达。TCR敲除的T淋巴细胞在回输入同种异体病人时不会引起移植物抗宿主病(GVHD)。