[发明专利]靶向抑制miR-34a的人工环状RNA的通用表达框架、表达方法及其应用

说明书

本发明涉及靶向抑制miR‑34a的人工环状RNA的通用表达框架、表达方法及其应用，该通用表达框架由上游序列、中间序列以及下游序列三部分组成。按本发明所述的靶向抑制miR‑34a的人工环状RNA通用表达框架可由质粒或病毒工具介导在细胞内表达靶向抑制miR‑34a的人工环状RNA分子，具备在胞内实现抑制miR‑34a‑5p生物功能的能力。本发明还涉及该通用表达框架及携带此表达框架的真核表达质粒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒在制备肥胖、脂肪肝、高脂血症和糖尿病的药物中的应用。

[技术领域]

本发明涉及靶向抑制miR-34a的人工环状RNA的通用表达框架、表达方法及其在制备肥胖、脂肪肝、高脂血症和糖尿病的药物中的应用。

[背景技术]

近年随着人们生活水平的提高，能量摄入过剩相关的肥胖、脂肪肝、高脂血症和糖尿病等诸多代谢异常疾病的患病率日益升高。据2018中国国民健康与营养大数据报告显示，超重或肥胖的国民或超过2亿，其中血脂异常(含高脂血症)患者1.6亿、脂肪肝患者1.2亿、糖尿病患者超过9000万，糖脂代谢异常疾病严重影响人们的健康，因此，开发有效调节糖脂代谢，维持糖脂代谢稳态的药物对于肥胖、脂肪肝、高脂血症和糖尿病的治疗具有重要价值。

肝脏在能量代谢过程中发挥重要作用，肝脏糖代谢和脂代谢功能的紊乱与包括肥胖、脂肪性肝病、高脂血症以及糖尿病等代谢类疾病的发生息息相关。CRTC2是维持肝脏糖脂代谢稳态的一个重要调节因子。研究证实，在长期能量摄入过剩的条件下，肝脏Crtc2高表达并激活Creb转录活性。Crtc2/Creb复合体启动miR-34a的转录，肝脏细胞高表达miR-34a抑制Sirt1/Pparα信号通路。做为肝脏甘油三酯代谢的重要调控通路，Sirt1/Pparα信号通路的抑制会导致脂代谢异常，肝脏和血液甘油三酯的含量上升。同时Sirt1/Pparα信号通路的抑制会降低FGF21的分泌，致使肝脏能量代谢失衡，胰岛素敏感性降低，胰岛负荷增加。因此，长期能量摄入过剩条件下，miR-34a过量表达诱导的sirt1/Pparα信号通路的长期抑制是肥胖、脂肪肝、高脂血症和糖尿病等代谢疾病的重要诱因。研究人员在高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型中证实，miR-34a的表达抑制是解除长期能量摄入过剩条件下肝脏病变和能量代谢失调的关键。因此，miR-34a作为靶点，在肥胖、脂肪肝、高脂血症和糖尿病的药物开发中极具价值。

目前，以microRNA作为靶点的药物开发主要集中在体外合成microRNA的模拟物或拮抗分子，在体内模拟或抑制microRNA的生物活性，以期进行疾病的治疗。例如EnGenelC开发的MesomiR-1(miR-16mimic)和Mirna Therapeutics开发的MRX34(miR-34mimic)两种核酸小分子药物，均为microRNA的模拟物。然而，限于核酸药物本身的理化性质，microRNA的模拟物或拮抗物药物开发存在诸多障碍，其中最主要的就是药物分子在体内靶向递送和半衰期。虽然目前核酸分子的化学修饰技术以及核酸药物的递送技术有了很大的提高，但是microRNA的模拟物或拮抗分子药物开发仍需更有效的解决递送效率和体内稳定性的问题。

[发明内容]

本发明的目的在于提供一种具备高效靶向抑制miR-34a的人工环状RNA及其通用表达框架，以及携带该人工环状RNA分子通用表达框架的真核表达质粒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒在制备肥胖、脂肪肝、高脂血症和糖尿病的药物中的应用。

为实现上述目的，本发明包括一种式I序列的人工环状RNA的通用表达框架，

其中，

US为上游序列，碱基序列如SEQ ID NO.1所示，

DS为下游序列，碱基序列如SEQ ID NO.2所示，

34inh为miR-34a-5p的吸附抑制位点的序列，碱基序列如SEQ ID NO.3所示，