[发明专利]核酸编码的CAR-T细胞及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种核酸编码的CAR‑T细胞的制备方法。将修饰有胆固醇的DNA直接与细胞混合，37℃孵育；加入修饰有抗体的互补DNA链，混合均匀，37℃孵育，得到所述核酸编码的CAR‑T细胞。所述制备方法反应条件简单，合成步骤少，耗时短，生产成本低。所述核酸编码的CAR‑T细胞用于癌症治疗时，生物相容性好，毒副作用小，可控性强，灵活多变，可有效杀伤肿瘤细胞。本发明所述CAR‑T细胞用于前期癌症治疗，具有潜在的应用价值。

技术领域

本发明属于医学诊疗领域，涉及一种免疫治疗细胞及其制备方法，特别是涉及一种可精确靶向肿瘤细胞的免疫细胞及其制备方法。

背景技术

癌症，是恶性肿瘤中最常见的一类，其致死率已跃居首位，据世界卫生组织统计，全世界每年约有400万人死于癌症。若治疗不及时，癌细胞会对身体持续啃蚀，直至夺走生命。传统上常使用的治疗手段是手术、化疗放疗等，但结果往往差强人意，接受治疗的患者5年存活率仅有50％左右。

免疫治疗旨在激活人体免疫系统，依靠自身免疫机能杀伤肿瘤细胞。免疫细胞是其中的关键一环，作为人体免疫的第三道防线，淋巴细胞在机体免疫应答中起到至关重要的作用。由于其免疫原性低、毒副作用小及生物相容性好等特性，淋巴细胞已被广泛地作为免疫治疗工具。近年来，嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)免疫疗法逐步走入人类的视野，因其是通过改造患者自身的T淋巴细胞实现对肿瘤细胞的靶向及杀伤，相较于其它的治疗方法，保证特异性、有效性的同时，安全性是绝对无可厚非的。

已存在的CAR-T细胞主要还存在以下几个问题：I.制备方面，体外T细胞的改造还存在操作复杂、耗时长等不足。II.靶向方面，肿瘤细胞表达的大多数抗原是非特异性，靶向肿瘤细胞的同时也会识别正常细胞，脱靶效应严重。III.效能方面，CAR-T细胞的大量回输，会给机体带来超负荷的细胞因子强度，毒副作用明显。因此，制备出简便、有效的CAR-T细胞用于肿瘤细胞的靶向及杀伤，将具有重要的研究意义和应用价值。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提供一种核酸编码的CAR-T细胞的制备方法，选用生物相容性好的DNA和T细胞作为原料，制备得到核酸编码的CAR-T细胞。该细胞具有良好的靶向识别能力，通过调控细胞表面修饰抗体的量有效控制细胞因子释放，安全、有效地促进对肿瘤细胞的杀伤。同时该方法能够有效解决CAR-T细胞制备的繁杂问题，针对癌细胞发展过程中表面特征分子的突变，可以通过及时调整修饰抗体的种类应对，有效改善靶标率，克服CAR-T细胞治疗脱靶严重、毒副作用强的不足。

本发明制备可促进肿瘤细胞杀伤的核酸编码的CAR-T细胞的治疗机理如图1所示，具体为：T细胞与抗体分别用两条互补的DNA链修饰，两者混合时，通过DNA链杂交作用，将抗体修饰到T细胞表面，最终形成核酸编码的CAR-T细胞。

根据上述原理，本发明采用如下的技术方案：

本发明提供了一种核酸编码的CAR-T细胞的制备方法，包括以下步骤：

(1)将细胞与末端修饰有胆固醇的单链DNA混合于培养基中，孵育，得到修饰有单链DNA的细胞；

(2)然后，向步骤(1)的体系(含有修饰有单链DNA的细胞)中，加入互补链DNA修饰的抗体，混合均匀，孵育，得到所述核酸编码的CAR-T细胞。

本发明为保证连接效率，所选用的DNA的碱基个数应大于等于10。

在一具体实施方式中，

步骤(1)中，所述修饰有单链DNA的细胞中，所述单链DNA的序列如SEQ ID NO.1所示：CACACACACACACACACACATTTTTTTT。

步骤(2)中，所述互补链DNA修饰的抗体中，所述互补链DNA的序列如SEQ ID NO.2所示：TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTTTTTTTT。