[发明专利]基于Illumina测序技术检测乙型肝炎分型及多耐药位点的试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种基于Illumina测序技术检测乙型肝炎分型及多耐药位点的方法，包括以下步骤：A：提取HBV基因组DNA；B：对HBV基因组DNA进行扩增，获得第一扩增产物；C：使用第二、三引物对扩增第一扩增产物，得到第二、三扩增产物；D：对第二、三扩增产物进行扩增，得到测序文库；E：对测序文库进行质检定量；F：上机测序；G：数据分析得到耐药位点及分型相关信息。本发明还公开了一种基于Illumina测序技术检测乙型肝炎分型及多耐药位点的试剂盒。采用本发明的方法具有灵敏度高、针对性强、成本低、通量大，准确性高等优点，能够有效检测HBV样品的多个耐药位点突变状态，尤其在低滴度样本上具有明显优势。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，是关于一种基于Illumina测序技术检测乙型肝炎分型及多耐药位点的试剂盒及方法。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)感染呈世界性流行，每年约有65万人死于HBV感染所致疾病。我国肝硬化和干细胞癌患者中，由HBV感染引起的比例分别为60％和80％。目前，核苷(酸)类似物(NA)如替比夫定(LdT)、阿德福韦酯(ADV)、恩替卡韦(ETV)、替诺福韦酯(TDF)等，已成为抗HBV感染的主要方法之一。随着NAs的长期应用，往往会出现病毒耐药株，造成NAs继续作用的困难。因此，在耐药早期进行检测往往可以起到更好的效果，而目前的检测手段往往难以检测到低滴度、低比例的HBV耐药突变，技术具有一定的局限性。

发明内容

本发明的首要目的是提供一种基于Illumina测序技术检测乙型肝炎分型及多耐药位点的方法，该方法能够有效检测到低滴度样本的多个位点低比例的突变状况，具有灵敏度高、针对性强、成本低、通量大，准确性高等优点，以解决现有的HBV病毒的多耐药位点突变检测难以检测到低滴度、低比例的HBV耐药突变的问题。本发明的第二个目的是提供一种基于Illumina测序技术检测乙型肝炎分型及多耐药位点的试剂盒及其应用。本发明的第三个目的是提供一种HBV分型及多耐药位点检测的系统。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

作为本发明的第一个方面，一种基于Illumina测序技术检测乙型肝炎分型及多耐药位点的方法，包括如下步骤：

A：提取检测样本中的HBV基因组DNA；

B：使用第一引物对，对所述HBV基因组DNA进行扩增，以得到第一扩增产物；

C：使用第二、三引物对，扩增所述第一扩增产物，得到第二、三扩增产物；

D：使用Illumina通用引物对对第二、三扩增产物进行扩增，得到测序文库；

E：对所述测序文库进行质检定量；

F：上机测序得到测序结果；

G：数据分析得到耐药位点及分型相关信息，

其中，第一引物对的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，第二引物对的序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示，第三引物对的序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示，如SEQ ID NO：3和如SEQ ID NO：5所示的引物均包括第一标签序列，所述第一标签序列具有选自SEQ ID NO：9-32所示的一种或多种核苷酸序列，如SEQ ID NO：4和如SEQ ID NO：6所示的引物均包括第二标签序列，所述第二标签序列具有选自SEQ ID NO：33-56所示的一种或多种核苷酸序列。由此，能够有效检测HBV样品的多个耐药位点突变状态，尤其在低滴度样本上具有明显优势。

根据本发明，所述检测样本为宿主样本的血清或血浆样本。

根据本发明，还包括对步骤D的测序文库进行分离纯化的步骤，分离纯化的方法选自琼脂糖凝胶纯化、磁珠纯化和纯化柱纯化等中的至少一种。