[发明专利]一种检测BCR-ABL融合基因ABL激酶区突变的方法

说明书

本发明提供了一种检测BCR‑ABL融合基因ABL激酶区突变的方法。该方法采用COLD‑PCR结合二代测序的方法检测外周血或骨髓中BCR‑ABL融合基因两种剪切型M‑bcr和m‑bcr中的ABL激酶区耐药突变，即在同一体系内先扩增M‑bcr和m‑bcr的BCR‑ABL融合基因，再进行COLD‑PCR扩增ABL激酶区，并利用CLOD‑PCR的原理封闭野生型模板，利用Tc温度富集少量突变基因，同时通过二代测序的方法提高检测灵敏度。本发明方法具有操作简单、重复性好、高通量检测标本、报告时间短等特点，尤其适用于少量突变克隆株的检测。使用该方法将显著提高突变检测的敏感度及复合突变的检测能力。

技术领域

本发明涉及基因组测序技术领域，具体地说，涉及一种检测BCR-ABL融合基因ABL激酶区突变的方法及试剂盒。

背景技术

慢性髓细胞白血病(chronic myelocytic leukemia，CML)是一种造血干细胞克隆增生性疾病，骨髓以髓系增生，外周血白细胞增多及脾脏肿大为主要特征。对CML而言，突变克隆的扩增可能是一个渐进的过程，开始阶段突变克隆比例较低，但一旦出现会很快增高并导致疾病恶化。耐药性的突变往往出现于CML急变期前或伴随急变期出现，因此定期监测突变情况是必要的，可以及早发现突变并相应调整治疗方案。对于某些预后不良的突变来说，在低水平时就较早地检测出来是非常有意义的。CML患者的BCR-ABL融合基因M-bcr剪切型的ABL激酶区耐药突变检测结果和Ph+(费城染色体)阳性的ALL(急性淋巴细胞白血病)患者m-bcr剪切型的ABL激酶区耐药突变的检测结果，为临床医生用药提供参考，如果能够在低水平突变时检测到突变，临床医师可以尽早调整治疗方案。

目前对ABL激酶区突变的检测主要是Sanger测序法和HRM法。Sanger测序法是从外周血或骨髓中提取RNA，采用随机引物逆转录cDNA，以此为模板做半巢式PCR分别扩增M-bcr和m-bcr两种剪切体的BCR-ABL融合基因，得到扩增产物后以其为模板，扩增ABL激酶区，得到的产物，用一代测序的方法检测其中ABL激酶区片段的突变。该方法只能检测突变频率高于10％-20％的突变，低于此频率的突变则会被漏检。

HRM法是在一定的温度范围内将BCR-ABL融合基因中ABL基因PCR扩增的产物进行变性，期间实时检测体系内荧光信号。荧光值随着温度变化，可绘制溶解曲线。每一段DNA都有其独特的序列，因而也就有了独特的熔解曲线形状，如同DNA指纹图谱一样，具有很高的特异性、稳定性和重复性。根据曲线准确区分野生型和突变型基因。上述Sanger测序法灵敏度低，HRM法只能检测样本中特定突变位点，如果要检测多个位点则成本较高，同时由于检测通量的局限性，不能批量检测而难以满足实际应用的需要。

二代测序技术已广泛应用于基础研究与临床基因检测，采用COLD-PCR结合二代测序的方法有望检测外周血或骨髓中BCR-ABL融合基因ABL激酶区突变，尤其适用于少量突变克隆株的检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种高灵敏度检测BCR-ABL融合基因ABL激酶区突变的方法及试剂盒。

本发明提供了一种检测BCR-ABL融合基因ABL激酶区突变的方法，包括步骤：从外周血或骨髓样本中提取RNA，随机引物逆转录成cDNA，再以cDNA为模板，在同一反应体系中扩增待测样品中BCR-ABL融合基因两种剪切型M-bcr和m-bcr，以扩增产物为模板，COLD-PCR扩增ABL激酶区，构建文库，文库混合制备模板后上机测序。

本发明的方法中，所述在同一反应体系中扩增待测样品中BCR-ABL融合基因两种剪切型M-bcr和m-bcr的方法为：以待测样品RNA逆转录而成的cDNA为模板，以SEQ ID NO.1-3所示序列为引物，进行PCR扩增。

SEQ ID NO.1、2、3所示序列的引物在PCR反应体系中初始物质的量比例为1:1:2。