[发明专利]一种从脐带中获得间充质干细胞的方法

权利要求书

1.一种从脐带中获得间充质干细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤，

脐带的洗涤与消毒：

将健康的脐带进行洗涤后再使其浸没到安尔碘或75％酒精中进行消毒，消毒时间不得超过30s，加入清洗液清洗1-2遍；或者，

将健康的脐带进行洗涤后再使其浸没到安尔碘或75％酒精中进行消毒，消毒时间不得超过30s，加入清洗液清洗1-2遍后，再使其浸没到75％酒精或安尔碘中进行消毒，每次消毒时间不得超过30s；再加入清洗液清洗1-2遍；

去除血管、分离华通氏胶：去掉脐带的头尾后，将剩余的脐带剪成1-3cm段；优选的，将剩余的脐带剪成1.5-2.5cm段；更优选的，将剩余的脐带剪成2cm段；用齿镊剥开外表皮，剔除静脉和动脉血管，剥离其中的华通氏胶，将华通氏胶用清洗液清洗；

铺板培养：华通氏胶中加入无血清培养基，使其刚好浸没华通氏胶，用剪刀将华通氏胶剪碎至0.1-1mm³；添加无血清培养基使剪碎的组织块重悬，再转移组织块到培养瓶中，并补加无血清培养基；使组织块平均分布在培养瓶上，并使培养基润湿整个瓶底，做好标记，放入培养箱内培养，6-8d内，优选的，7d内不得移动；培养箱培养；优选的，培养条件为37度5％CO₂饱和湿度培养；

换液培养并收获：7d后在每个培养瓶内补加培养基，第10d换液，吸去原培养基，每瓶加入新鲜培养基25mL，继续培养；第14d时或细胞汇合度达到45-55％；优选的，达到50％即可收获；

消化过滤：弃去原培养基，加入生理盐水清洗后加入含EDTA的胰酶孵育，待细胞变圆脱落时再加入胰酶终止液进行细胞收集，收集的细胞进行离心，弃去上清，用生理盐水重悬细胞后过70um细胞筛过滤除去组织块，再次离心去掉上清。

2.如权利要求1所述从脐带中获得间充质干细胞的方法，其特征在于，所述健康的脐带的产妇为无家族史和遗传史的足月待产剖腹产的产妇，产妇将胎儿娩出后胎儿健康无畸形或先天性疾病。

3.如权利要求1所述从脐带中获得间充质干细胞的方法，其特征在于，所述脐带在胎儿娩出后，常规断脐，选取中部10-20cm的脐带，用酒精纱布清洁消毒后剪断。

4.如权利要求1所述从脐带中获得间充质干细胞的方法，其特征在于，所述脐带的洗涤与消毒步骤中，脐带加入清洗液，盖上盖子后上下颠倒清洗，如此反复2-4次后，再转移脐带，加入安尔碘消毒液，使其浸没整个脐带，盖上盖子立即上下颠倒2-4次后转移脐带，再加入清洗液清洗，整个过程不得超过30s；清洗完毕后再转移脐带，加入75％酒精浸没脐带，盖上盖子立即上下颠倒2-4次后转移脐带，整个过程不得超过30s，加入清洗液清洗1-3遍。

5.如权利要求1所述从脐带中获得间充质干细胞的方法，其特征在于，所述去除血管、分离华通氏胶步骤中，去掉脐带的头尾各0.5-1.5cm后；优选的，去掉脐带的头尾各1cm后，将剩余的脐带剪成1-3cm段；更优选的，将剩余的脐带剪成1.5-2.5cm段；更优选的，将剩余的脐带剪成2cm段；用齿镊剥开外表皮，剔除静脉和动脉血管，剥离其中的华通氏胶，将华通氏胶用清洗液清洗1-3遍；优选的，清洗3遍。

6.如权利要求1所述从脐带中获得间充质干细胞的方法，其特征在于，所述换液培养并收获步骤中：7d后在每个培养瓶内补加培养基；优选的，按照培养瓶底面积每10cm²补加培养基0.5-0.8mL，更优选的，按照培养瓶底面积每10cm²补加培养基0.6mL；第10d换液，吸去原培养基，每瓶加入新鲜培养基；优选的，按照培养瓶底面积每10cm²补加培养基0.1-0.5mL，更优选的，按照培养瓶底面积每10cm²补加培养基0.3mL继续培养；第14d时或细胞汇合度达到45-55％；优选的，达到50％即可收获。

7.如权利要求1所述从脐带中获得间充质干细胞的方法，其特征在于，所述消化过滤步骤中，弃去原培养基，加入生理盐水清洗1-2遍后加入含EDTA的胰酶；优选的，每10cm²添加0.1-0.5mL；更优选的，每10cm²添加0.3mL；室温孵育3-6min，待细胞变圆脱落时再加入胰酶终止液；优选的，每10cm²添加0.5-0.8mL；更优选的，每10cm²添加0.6mL；进行细胞收集，收集的细胞进行离心300g，5min，弃去上清，用生理盐水重悬细胞后过70um细胞筛过滤除去组织块，再次300g，5min离心去掉上清。