[发明专利]一种从脐带中获得间充质干细胞的方法

说明书

本发明公开了一种从脐带中获得间充质干细胞的方法。包括，脐带洗涤后用安尔碘和/或75％酒精消毒：再去除血管、分离华通氏胶；铺板培养；换液培养并第14d或细胞汇合度达到45‑55％收获：消化过滤。本发明所述方法可更加快速的获得原代间充质干细胞(<15day)，操作更加简便，相同量组织块下获得的原代间充质干细胞数量更多，且能够有效的避免污染，无需在后续的培养中加入抗生素来防止细胞污染。

技术领域

本发明涉及细胞制备领域，尤其涉及一种从脐带中获得间充质干细胞的方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)是来源于发育早期中胚层和外胚层的一类多能干细胞。MSC具有免疫调节、促进造血恢复、能够修复损伤或病变的组织器官、具备多向分化潜能等功能,因此具有广泛的应用前景。

但是目前从脐带中制备间充质干细胞的方法耗时长，获得的间充质干细胞数量少，同时操作过程中容易污染。

比如CN105586309A公开的是从脐带中制备间充质干细胞的方法，将添加抗生素的清洗液清洗后的脐带剪成约2cm长度的小段，经过处理后再充分剪碎成1-3mm³～3mm³大小，平分到已加完全培养基的175cm²培养瓶中，轻轻摇晃使其均匀分布于瓶底；培养箱中培养，第八天更换培养基，将得到的细胞液离心，重悬，铺瓶后培养箱中培养。此方法使得后续的培养经常不得不通过添加抗生素来防止污染，增加了临床应用的安全隐患。同时操作时间长。组织块过大，能铺的培养瓶数目少，细胞数目也相应较少。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从脐带中获得间充质干细胞的方法。所述方法可更加快速的获得原代间充质干细胞(<15day)，操作更加简便，相同量组织块下获得的原代间充质干细胞数量更多，且能够有效的避免污染，无需在后续的培养中加入抗生素来防止细胞污染。

为实现上述目的，本发明提供一种从脐带中获得间充质干细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤，

脐带的洗涤与消毒：

将健康的脐带进行洗涤后再使其浸没到安尔碘或75％酒精中进行消毒，消毒时间不得超过30s，加入清洗液清洗1-2遍；或者，

将健康的脐带进行洗涤后再使其浸没到安尔碘或75％酒精中进行消毒，消毒时间不得超过30s，加入清洗液清洗1-2遍后，再使其浸没到75％酒精或安尔碘中进行消毒，每次消毒时间不得超过30s；再加入清洗液清洗1-2遍；

去除血管、分离华通氏胶：去掉脐带的头尾后，将剩余的脐带剪成1-3cm段；优选的，将剩余的脐带剪成1.5-2.5cm段；更优选的，将剩余的脐带剪成2cm段；用齿镊剥开外表皮，剔除静脉和动脉血管，剥离其中的华通氏胶，将华通氏胶用清洗液清洗；

铺板培养：华通氏胶中加入无血清培养基，使其刚好浸没华通氏胶，用剪刀将华通氏胶剪碎至0.1-1mm³；添加无血清培养基使剪碎的组织块重悬，再转移组织块到培养瓶中，并补加无血清培养基；使组织块平均分布在培养瓶上，并使培养基润湿整个瓶底，做好标记，放入培养箱内培养，6-8d内，优选的，7d内不得移动；培养箱培养；优选的，培养条件为37度5％CO₂饱和湿度培养；

换液培养并收获：7d后在每个培养瓶内补加培养基，第10d换液，吸去原培养基，每瓶加入新鲜培养基25mL，继续培养；第14d时或细胞汇合度达到45-55％；优选的，达到50％即可收获；

消化过滤：弃去原培养基，加入生理盐水清洗后加入含EDTA的胰酶孵育，待细胞变圆脱落时再加入胰酶终止液进行细胞收集，收集的细胞进行离心，弃去上清，用生理盐水重悬细胞后过70um细胞筛过滤除去组织块，再次离心去掉上清。